人宮頸癌SiHa細胞荷瘤裸鼠模型的建立及鑒定

侯柏龍，杜王琪，熊一融，蔡一奇，宋易玲，林曉云，薛向陽，張麗芳（.溫州醫科大學 分子病毒與免疫研究所、微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 35035；.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 3505）

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人宮頸癌SiHa細胞荷瘤裸鼠模型的建立及鑒定

侯柏龍1，杜王琪1，熊一融1，蔡一奇2，宋易玲1，林曉云1，薛向陽1，張麗芳1
（1.溫州醫科大學 分子病毒與免疫研究所、微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325015）

[摘 要]目的：建立人宮頸癌SiHa細胞裸小鼠體表荷瘤模型，并對其成瘤特性進行分析和鑒定。方法：將5×106/mL、1×107/mL及5×107/mL 3個濃度的SiHa細胞懸液分別在3組裸小鼠背部右腋近上肢皮下接種，建立人宮頸癌裸小鼠體表荷瘤模型，觀察荷瘤裸鼠的成瘤率并測量腫瘤的大小，5周后取腫瘤組織經病理學方法觀察其組織學特性，并采用PCR及免疫組織化學方法對腫瘤組織的HPV16E7 DNA表達進行檢測。結果：3組裸小鼠接種SiHa細胞的成瘤率均為100%，5周后腫瘤大小分別達到（77.29±28.34）mm3、（178.91± 61.55）mm3和（305.11±12.62）mm3。3個濃度組間腫瘤體積大小差異有統計學意義（P＜0.001）。病理學大體觀察可見SiHa腫瘤的生長均以局部浸潤為主；組織切片觀察新生腫瘤細胞特點呈現體積大、核大深染及易見核分裂相的病理性特征；SiHa新生腫瘤組織經PCR檢測證實了HPV16E7 DNA陽性，并經免疫組織化學檢測證實了HPV16E7蛋白表達陽性。結論：成功建立了SiHa細胞荷瘤裸鼠模型，為人宮頸癌腫瘤靶向治療及生物學特性研究提供了理想的動物模型。

[關鍵詞]宮頸腫瘤；動物模型；BALB/c-nu裸小鼠；SiHa細胞

宮頸癌是全球最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌排第二位，而我國宮頸癌患病率和病死率約占世界的28.8%，宮頸癌患病人數約占世界三分之一[1]。宮頸癌的發病與人乳頭瘤病毒（human papilloma-virus，HPV）感染的相關性已經明確，且基于HPV L1蛋白的宮頸癌預防性疫苗也已經商業化[2]，但宮頸癌的治療尚未獲得突破性研究進展。盡管HPV型別眾多，其高危型別（HPV16、18、31、33、58等）也具有地域分布特性，但流行病學研究表明HPV16感染為全球宮頸癌致病主要型別[3]。因此，本研究采用人HPV16 DNA陽性的SiHa細胞株接種建立人宮頸癌荷瘤裸鼠模型，為宮頸癌治療及其發病機制研究提供了基礎。

1 材料和方法

1.1細胞株 人宮頸癌SiHa細胞購自上海中科院細胞庫（HTB-35）。常規方法從液氮罐中取出SiHa細胞凍存液，迅速經37 ℃水浴后加入RPMI-1640培養液吹打混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，吹打成細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。觀察細胞生長情況，細胞長至80%融合時，用胰酶消化傳代后備用。

1.2實驗動物 BALB/c裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（合格證號：SCXK（滬）2012-0002），21只，雌性未孕，成熟健康，鼠齡5～8周，體質量18～25 g，SPF級，在溫州醫科大學動物實驗中心屏障系統內飼養。所有進入屏障系統的飼料、水、空氣、鋪墊物及各種用品均需經過高溫高壓等滅菌處理；所有進入實驗室的人、動物均需經過嚴格的微生物控制。

1.3試劑 RPMI-1640細胞培養液、胎牛血清FBS均購自Gibco公司；各組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；HPV16 E7特異性兔抗體由本實驗室提供；HRP標記的羊抗兔IgG（H+R）抗體購自聯科生物技術有限公司。

1.4腫瘤動物模型的建立 裸小鼠適應性生長1周后，隨機分為3組，每組7只。取對數生長期的SiHa細胞，用胰酶消化后，用PBS分別配制成5×106/mL、1×107/mL和5×107/mL，即低、中、高3個不同濃度的單細胞懸液，在無菌條件下皮下注射接種于裸小鼠背側近右腋窩處，每只0.2 mL。

1.5腫瘤特征的觀察 每隔1 d觀察裸小鼠的精神狀態、活動力、反應、飲食、體質量、皮下接種區域外觀及觸感。每3 d用電子游標卡尺測量瘤體最長徑a和最短經b，按公式V=1/2（ab2）計算腫瘤體積[4]。以腫瘤體積和生長周數分別為坐標繪制不同接種濃度下的腫瘤生長曲線。

1.6形態學和組織學檢查 ①大體形態檢查：接種SiHa細胞懸液5周后處死荷瘤裸鼠，解剖觀察腫瘤形態、直徑、質地、活動度及腦、肝、肺、腎等轉移情況。②組織學檢查：將標本送至溫州醫科大學基礎醫學院病理解剖學教研室，部分腫瘤組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋常規切片和HE染色，顯微鏡觀察細胞形態特征；另外部分腫瘤組織進行免疫組織化學檢測HPV16E7蛋白的表達情況。剩余腫瘤組織及主要器官（肝臟、肺臟和大腦等）組織置液氮保存，用于PCR檢測HPV16E7的DNA表達。

1.7PCR方法檢測 根據HPV16E7的全長DNA序列，設計HPV16E7 PCR引物[5]，上游引物為：5’-GGAATTCCA TATGCATGGAGATACACCT-3’，下游引物為：5‘-CCGCTC GAGTGGTTTCTGAGAACAGA-3’；各組織DNA提取則采用試劑盒進行，方法按說明書操作，提取本實驗中荷瘤裸鼠腫瘤組織及腦、肝、肺、腎等的DNA，分別以這些組織的DNA為模板，通過PCR擴增HPV16 E7 DNA全長基因。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃延伸10 min，PCR反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8免疫組織化學方法檢測 取上述石蠟包埋的各腫瘤組織進行切片（厚度為3 μm），常規脫蠟、固定、抗原修復后，以HPV16E7特異性兔血清多克隆抗體（1:100稀釋）為一抗，4 ℃孵育過夜。 以HRP標記的羊抗兔IgG（H+R）抗體（1:500稀釋）為二抗，室溫孵育2 h，經DAB顯色、蘇木精復染和脫水后進行封片。同時以PBS兔血清代替一抗作為陰性對照。

1.9統計學處理方法 采用SPSS18.0軟件進行統計學處理。實驗數據以±s表示，同一時間段各組間腫瘤組織平均體積差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1成瘤潛伏期與成瘤率 21只荷瘤裸鼠全部存活，成瘤率均為100%。3個濃度組5×106/mL、1× 107/mL和5×107/mL的荷瘤裸鼠成瘤潛伏期分別為（11.71±1.80）d、（9.00±2.87）d、（6.14±1.07）d。5周后3組荷瘤裸鼠腫瘤大小分別達到（77.29± 28.34）mm3、（178.91±61.55）mm3、（305.11±12.62）mm3，3組間腫瘤體積大小差異有統計學意義（均P＜0.001）。

2.2荷瘤裸鼠腫瘤大小及一般特性觀察 裸小鼠接種SiHa細胞后，腫瘤呈持續性生長（見圖1A）。在第1周5×106/mL組和5×107/mL組腫瘤大小差異有統計學意義（P＜0.01），在第2周5×106/mL組和1×107/mL組腫瘤大小差異有統計學意義（P＜0.05），在第3周1×107/mL組和5×107/mL組腫瘤大小差異有統計學意義（P＜0.001）（見圖1B）。所有荷瘤裸鼠接種SiHa細胞后一般狀況尚可，活動量正常，反應敏捷，進食及進水量無明顯變化，體質量無明顯變化。

2.3形態學和組織學檢測結果 第5周將荷瘤裸鼠麻醉處死，解剖觀察，移植瘤大多呈結節狀，與皮膚粘連甚少，腫瘤有清楚的組織界限，外觀呈乳頭結節或分葉狀，血供豐富且易分離，腫瘤組織切面呈魚肉樣；肝、腦、肺和腎等組織未見明顯的轉移結節。經制備腫瘤組織病理切片，在普通顯微鏡光鏡下觀察，可見腫瘤組織癌巢、血管擴張充血、小灶凝固性壞死和少量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤；腫瘤細胞呈現體積大、核大深染且易見核分裂相等腫瘤病理性特征，肝、腦、肺和腎等均未見明顯的轉移灶（見圖2）。

2.4PCR檢測結果 各組裸小鼠腫瘤組織提取DNA后，經HPV16E7特異性引物PCR后進行瓊脂糖電泳鑒定，結果在分子質量約300 bp處可見單一條帶，與HPV16E7全長基因大小一致（見圖3A），而腦、肝、肺、腎和肌肉等組織未見明顯的單一DNA條帶（見圖3B）。

圖1　不同濃度組的腫瘤體積生長情況

圖2　腫瘤和其他器官組織的病理切片（×400）

圖3　腫瘤及各器官組織DNA PCR檢測產物電泳圖

2.5免疫組織化學檢測結果 新生腫瘤組織及肝、腦、肺、腎等組織切片經免疫組化分析，以HPV16E7特異性兔血清抗體為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG（H+R）抗體為二抗（見圖4A），同時以PBS兔血清代替一抗作為陰性對照，其余步驟均一樣（見圖4B）。結果可見，只有圖4A腫瘤組織切片中在細胞質和核膜周圍出現團狀或點塊狀棕黃色沉淀顆粒，其他切片結果均未見。

圖4　各器官組織細胞中HPV16 E7蛋白的表達（×400）

3 討論

為了更加深入地研究宮頸癌的發生發展及其治療，動物模型的建立對基礎醫學和臨床醫學研究宮頸癌均有重要的意義。人類理想的動物模型要求其發生部位、類型、病因、發生機制及其生物學行為等方面符合所研究的人類腫瘤[6-7]。至今為止，宮頸癌動物模型的制作主要分為自發性腫瘤模型、誘發性腫瘤模型、基因修飾（轉基因）腫瘤模型和移植性腫瘤模型四大類[8]，前面三種模型制作方法具有操作復雜，耗時漫長，腫瘤發生率較低且不穩定、發生時間難以預測、個體差異大和成本高昂等缺陷[9]。相比較而言，移植性腫瘤模型具有制作簡便的優點。尤其是，裸小鼠的遺傳背景明確，性狀穩定，因免疫缺陷而不發生免疫排斥反應[10]，可進行體表部位腫瘤移植而形成體表移植瘤，是目前應用最廣泛的研究動物模型，也是研究腫瘤病因和篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型[11]。因此，本研究選擇裸小鼠作為宮頸癌細胞荷瘤裸鼠進行移植性腫瘤模型的構建。荷瘤裸鼠模型成功率高且對動物損傷小、死亡率低；研究的可重復性好，動物大小、體形及生物學行為等適合于所做的實驗研究要求；所用制作方法對人體危害較少，對環境的污染小。

目前報道的人宮頸癌HPV陽性的動物模型主要為HeLa-229荷瘤裸鼠，而人宮頸癌HPV16陽性的SiHa細胞、Caski細胞荷瘤裸鼠模型報道并不深入[12]。本研究采用SiHa（HPV16+）細胞接種裸小鼠建立人宮頸癌動物模型，裸小鼠移植瘤的成功率達100%，移植瘤生長迅速、良好，實驗中裸小鼠全部存活，活動良好，體質量逐漸增加，適用于宮頸癌動物模型。實驗中，裸鼠成瘤時間與接種的細胞濃度高低有關，濃度越高成瘤時間越短。提示要想短時間建模成瘤，在一定濃度范圍內接種細胞濃度越高越好。同時，移植瘤體積大小和接種細胞數呈劑量依賴性（見圖1），即同一時間點，腫瘤大小與接種細胞濃度呈正相關；同一濃度的組內，各裸小鼠腫瘤大小也存在差異，甚至差異可達到263.72 mm3，筆者認為此與裸小鼠個體之間的差異有關。在制備動物模型進行腫瘤靶向治療及生物學特性等研究時，裸小鼠數量足夠，才能選擇腫瘤大小較一致的個體進行后續實驗。此外，隨著時間的推移，腫瘤的體積也在不斷增大，但達到一定的程度時，腫瘤體積增長速度減緩，而裸小鼠開始出現惡病質的情況，筆者考慮這是由于裸小鼠進入惡病質階段后，攝取營養能力下降，腫瘤細胞攝取營養的量也較前減少，增長速度減慢。

宮頸癌是一個由癌前病變逐漸衍變為癌的連續性病理過程。目前大量研究已證實HPV是感染宮頸癌的主要危險因素。已有的研究[13]表明，90%以上的宮頸癌標本中有HPV DNA的存在。高危型HPV持續感染及多重感染是導致宮頸癌變的重要原因之一。HPV高危型別的E7是誘導宮頸癌細胞轉化的腫瘤原性蛋白，也是轉化細胞持續表達的病毒特異性蛋白，因此E7是宮頸癌治療研究的靶位點[14]。本研究除了一般移植瘤的特性檢測之外，對HPV16 E7的特異性指標（即HPV16 E7 DNA和蛋白表達）采用PCR和免疫組化的方法進行鑒定，從而從分子水平進行了人宮頸癌荷瘤裸鼠模型的鑒定。

此外，本研究中荷瘤裸鼠經5周觀察，并經解剖大體、病理切片組織學、免疫組化和PCR檢測（見圖3-4），均未發現有體表腫瘤向各主要器官轉移的證據。這表明SiHa細胞荷瘤裸鼠在建模的5周內基本不發生遠處轉移，可能與本研究采用單細胞懸液皮下接種的方法有關。我們將SiHa細胞懸液移植于腋部皮下，在起初的第1～第4天，裸小鼠皮下有囊性包膜形成，由于血供不豐富，淋巴引流較差，腫瘤細胞在原接種部位生長，而不易造成浸潤和轉移。腫瘤細胞接種后的第6天，可觀察到接種部位囊性包塊被吸收而呈現實質性、米粒大小的瘤體。之后，隨著裸小鼠周齡的增加，腫瘤也開始增大（見圖1）。整個實驗過程當中，未發現裸小鼠有偏癱、行走不穩（腦轉移）、呼吸費力、發紺（肺轉移）、攝食減退、黃疸、活動度下降（肝轉移）等重要器官腫瘤轉移的跡象，也未發現生物學行為有較大的變化。我們認為采用單細胞懸液皮下接種的方法具有操作簡單、腫瘤表淺、便于觀察及測量瘤體大小、潛伏期短、腫瘤生長速度較快且不易轉移的優點。

現在，人類已經在HPV的基礎研究、病原學診斷等諸多方面有了極大進步，在流行病學領域也得到了準確的資料。本研究通過裸小鼠接種SiHa細胞成功建立了宮頸癌動物模型，以5×107/mL濃度接種最快可在3 d時觸摸到米粒大小的瘤體，經觀察21 d，瘤體大小可達（200.61±48.04）mm3，可以進行后續的治療和特性研究。經5周觀察，荷瘤裸鼠一般狀態良好，沒有發生遠處轉移。同時本實驗對HPV16 E7 DNA和蛋白表達分別采用PCR和免疫組化的方法進行鑒定，進一步從分子水平進行了人宮頸癌荷瘤裸鼠模型的鑒定。本實驗為宮頸癌相關研究的后續工作，提供了快速建模的劑量-時間數據。和其他報道[15-16]相比，本實驗數據更多更細化。相比其他研究者一般僅從組織水平進行驗證報道，本研究則分別從分子水平、組織水平及動物的大體水平進行了驗證，為后期宮頸癌靶向治療研究奠定了基礎。本研究的技術方法以及實驗結果可為建立人宮頸癌HPV16陽性的荷瘤裸鼠模型提供理論依據。

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（本文編輯：吳昔昔）

Establishment and identification of human cervical cancer SiHa cells tumor bearing model in nude mice

HOU Bailong1,DU Wangqi1,XIONG Yirong1,CAI Yiqi2,SONG Yilin1,LING XiaoYun1,XUE Xiangyang1,ZHANG Lifang1.1.Institute of Molecular Virology and Immunolog,Department of Microbiology and Immunology,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Gastrointestinal Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To establish human cervical cancer SiHa cells tumor bearing model on the body surface area in nude mice,and analyze its tumor characteristics.Methods:Three groups nude mice were subcutaneous inoculated with 5×106/mL,1×107/mL and 5×107/mL concentrations of cervical cancer SiHa cells in the right axillary close to upper limbs,to establish human cervical cancer SiHa cells tumor bearing model in nude mice.The tumor of nude mice was observed and the size of tumor was measured.The histological characteristics of tumor tissue was observed by pathological method after 5 weeks.HPV16E7 DNA of tumor tissue was comfirmed by PCR assay,and the expression of HPV16 E7 protein in tumor tissue was detected by immunohistochemistry method.Results:The tumor rate of 3 groups of nude mice inoculation with SiHa cell line was 100%.Their tumor sizes reached up (77.29±28.34) mm3,(178.91±61.55) mm3and (305.11±12.62) mm3after 5 weeks,and there was a significant difference among 3 groups (P<0.001).Pathology observation showed the growth of SiHa cell tumors were mainly in local infiltration.Histopathological of slice observation showed the new SiHa cells tumor tissue appeared pathological characteristics of large volume,large nucleus,nucleus deep dyeing and the mitotic phase.HPV16E7 DNA and the protein expression were positive comfirmed by PCR and immunohistochemistry detection respectively in tumor tissue.Conclusion:Human cervical cancer SiHa cells tumor bearing model in nude mice was established successfully,and provide an ideal animal model for human cervical cancer tumor targeted therapy and biological research.

Key words:uterine cervical neoplasms; animal models; BALB/c nude mice; SiHa cells

通信作者：張麗芳，教授，Email：wenzhouzlf@126.com。

作者簡介：侯柏龍（1988-），女，山西晉城人，檢驗技師，碩士。

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81176423）。

收稿日期：2015-03-24

[中圖分類號]R3

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.02.004