全肺去細胞生物支架的制備與鑒定

陳嬋，王志斌，翁杰，虞青，徐恩盼，陳納，孟卓，杜曉紅，陳世新（.溫州醫科大學附屬第一醫院 老年醫學科，浙江 溫州 505；.溫州醫科大學 解剖學教研室，浙江溫州 505；.溫州醫科大學附屬第二醫院 急診科，浙江 溫州 507；.溫州醫科大學 第二臨床醫學院臨床醫學系，浙江 溫州 505）

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全肺去細胞生物支架的制備與鑒定

陳嬋1，王志斌2，翁杰3，虞青4，徐恩盼4，陳納4，孟卓4，杜曉紅1，陳世新2
（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 老年醫學科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學 解剖學教研室，浙江溫州 325035；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 急診科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫科大學 第二臨床醫學院臨床醫學系，浙江 溫州 325035）

[摘 要]目的：通過聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、十二烷基磺酸鈉（SDS）灌注法制備大鼠全肺去細胞生物支架，并對其進行鑒定。方法：20只SD大鼠隨機數字表法分成去細胞組與正常對照組，每組10只，分別取心、肺聯合體，去細胞組經右心室置入留置針至肺主動脈，恒溫37 ℃依次灌注肝素化PBS溶液、1% TirtonX-100、0.8% SDS及去離子水。進行DNA定量分析，HE染色及免疫熒光觀察殘留細胞及細胞核成分，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹脂（ABS）鑄型觀察肺內血管分布情況。結果：去細胞組DNA含量為（40.37±5.01）ng/mg，較正常對照組的（846.64±65.70）ng/mg下降95%以上；HE染色及免疫熒光染色見去細胞組肺生物支架保留了大量細胞外基質，未見明顯細胞及細胞核成分殘留；血管鑄型標本顯示去細胞組血管分布與正常對照組相仿，其分支完整、清晰。結論：TritonX-100、SDS灌注法可有效清除肺內細胞成分，較好地保留細胞外基質（ECM）和血管網絡結構，是一種簡便且較為理想的制備組織工程肺生物支架方法。

[關鍵詞]去細胞；肺；細胞外基質；組織工程；大鼠

肺移植被認為是終末期肺疾病唯一有效的治療手段，但臨床上供體肺來源匱乏[1]，患者移植后的免疫抑制、慢性排斥和潛在的疾病傳播等問題嚴重制約肺移植術的開展。隨著組織工程技術的發展，應用人工肺替代移植肺成為肺移植治療的新方向[2]。人工肺的構建主要依賴復雜的細胞源、支架材料及培養環境三個要素，其中適宜的支架材料是構建人工肺的重要基礎[3]。近年來，有研究報道利用去細胞技術制備天然生物支架材料，其生物相容性好，能被異種宿主耐受，且可被機體降解[4]。因此，去細胞技術逐漸成為組織工程研究領域的熱點。本研究主要采用化學去垢劑洗滌法成功制備大鼠全肺去細胞生物支架，為研究組織工程肺的生物支架材料提供了一種較理想的方法。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：健康雄性SD大鼠20只，體質量（290±20）g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，SPF級無菌環境飼養，動物生產許可證號：SCXK（浙）2010-0044。

1.1.2主要試劑：十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100，美國Sigma公司）；青霉素-鏈霉素抗生素混合液（上海博蘊生物有限公司）；DNA檢測試劑盒（美國Omega公司）；兔抗膠原IV蛋白抗體、層粘連蛋白（laminin，LN）抗體、彈性蛋白抗體、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹脂（ABS）蘇丹紅溶劑（美國Invitrogen公司）。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理方法：20只SD大鼠按隨機數字表法分成去細胞組與正常對照組，每組10只。對照組SD大鼠按0.3 mL/100 g 10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，全麻后打開胸腔，分離出下腔靜脈，從下腔靜脈注射肝素2 mL，行全身肝素化處理，分離切取新鮮全肺和心臟。去細胞組在正常對照組基礎上，采用去細胞技術制備全肺去細胞支架。

1.2.2肺臟去細胞生物支架制備：參考文獻[5]，將分離切取新鮮全肺和心臟，從右心室插入動脈22 G留置針，置管至肺主動脈后結扎固定，肝素PBS沖洗肺臟殘留血液至肺呈土黃色。采用TritonX-100、SDS灌注法，將灌注液從肺主動脈按下列順序灌注，先500 mL 1% TirtonX-100灌注，再2 000 mL 0.8%的SDS灌注，最后去離子水灌注4 h，整個灌注過程恒溫37 ℃，灌注壓控制在8 mmHg以內，灌注液流速約8 mL/min。灌注過程中觀察各時間點肺臟顏色及形態的變化，將制備的肺去細胞生物支架用PBS沖洗干凈，4 ℃含抗生素PBS保存備用。

1.2.3去細胞全肺生物支架的觀察與鑒定方法：①大體觀察：觀察新鮮全肺及灌注過程各時間點全肺的顏色及形態變化。②基因組DNA含量分析：分別切取正常對照組與去細胞組肺組織約100 mg，經勻漿、細胞裂解、去蛋白及純化后，提取基因組DNA（參照DNA試劑盒說明操作），紫外分光光度計測定其濃度。③HE染色觀察：正常對照組及去細胞組肺組織經4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，常規HE染色后光鏡下觀察。④免疫熒光染色觀察：分別制備正常對照組及去細胞組肺組織石蠟切片，DAPI免疫熒光染色2組肺組織細胞核。⑤去細胞組同時行膠原IV、LN及彈性蛋白免疫熒光染色，具體參考試劑說明書操作，熒光顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色熒光，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）主要蛋白成分免疫熒光染色出現綠色熒光為陽性表達。⑥肺動脈血管鑄型觀察：正常對照組及去細胞組全肺組織分別經肺動脈灌注10% ABS蘇丹紅溶劑2～3 mL，灌注時保持壓力恒定，PBS液沖洗冷卻，50%鹽酸腐蝕l～3 d，清水沖洗干凈，體視顯微鏡下觀察2組肺內血管形態及分布。

1.3統計學處理方法 采用SPSS18.0統計軟件對數據分析處理，正態分布的計量資料用±s表示，組間參數比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.12組大體觀 正常對照組肺呈淡粉紅色，血管內可見殘留血液；去細胞組肺在灌注過程中逐漸由外至內變白，且逐漸變半透明，灌注完畢全肺變為乳白色半透明狀，肉眼可清晰觀察到肺內血管大體分支形態，見圖1。

2.22組基因組DNA含量分析 去細胞組肺支架DNA含量顯著低于正常對照組肺組織（P＜0.01）；去細胞的比例可達95%以上，2組提取的DNA標本A260/ A280比值均在1.8～2.0，標本DNA純度較高，見表1。2.3 2組HE染色觀察 HE染色顯示正常對照組肺組織結構呈網格狀分布，細胞核清晰；去細胞組肺組織僅可見網格狀結構，去細胞支架上未見殘存細胞及細胞核等結構，見圖2。

2.42組免疫熒光觀察 正常對照組肺組織DAPI熒光顯示藍色胞核清晰；去細胞組未見明顯DAPI與細胞核結合后發出的藍色強熒光，見圖3A-B。LN、膠原IV及彈性蛋白主要表達于系膜、基膜及ECM中，去細胞組LN、膠原IV蛋白及彈性蛋白免疫熒光染色呈綠色網格狀，結構完整，見圖3C-E。

2.5肺血管鑄型觀察 正常對照組及去細胞組肺血管均呈“樹枝樣”分布，正常對照組肺血管分布密集，形態完整；去細胞組肺內血管分布與正常對照組相仿，血管分支清晰可見，形態完整，見圖4。

圖1　全肺去細胞過程中肉眼觀察變化

表1　2組肺組織DNA含量測定（n=10，±s）

表1　2組肺組織DNA含量測定（n=10，±s）

與正常對照組比：aP＜0.01

組別　D N A含量（n g / m g干重）　A 2 6 0 　A 2 8 0 　A 2 6 0 / A 2 8 0正常對照組　8 4 6 .6 4 ± 6 5 .7 0a　1 9 .3 7 8 ± 1 .6 6 9 　1 0 .2 9 4 ± 1 .0 3 9 　1 .8 8 6 ± 0 .0 5 9去細胞組　 4 0 .3 7 ± 5 .0 1a　 0 .3 0 8 ± 0 .0 4 5 　 0 .1 6 6 ± 0 .0 2 1 　1 .8 5 3 ± 0 .0 5 5

圖2　肺組織病理學HE染色（×200）

圖3　免疫熒光染色（×400）

A：正常對照組：肺動脈分布密集，形態完整；B：去細胞組：肺動脈血管分布與正常對照組相仿，血管分支清晰完整

3 討論

去細胞生物支架制備技術主要是通過酶學法和化學法浸泡灌注組織器官，去除組織器官實質細胞及可溶性蛋白成分，保留其不溶性ECM[6]，其主要成分包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白、LN等[7]，這些蛋白質通過正常比例排列成空間構象，為組織臟器實質細胞提供生長發育的附著點，是維持臟器正常結構與功能的組織學基礎。2008年Ott等[8]采用小鼠離體心臟，經去細胞技術制備心臟ECM，并重新注入新生小鼠細胞，體外培養后使心臟復跳，這一研究使體外器官組織再生成為可能。

目前，國內外學者已經成功制備了肺臟、心臟、腎臟、皮膚、血管、神經、肌腱等組織器官的去細胞生物支架。制備方法主要通過胰蛋白酶、脫氧核糖核酸。去細胞組肺支架DNA含量顯著低于正常對照組肺組織（P＜0.01），去細胞的比例可達95%以上，2組提取的DNA標本A260/A280比值均在1.8～2.0，表明標本DNA純度較高。

胰蛋白酶消化水解，聯合灌注SDS、Trition X-100、Trition X-200、脫氧膽酸鈉等化學去垢劑[9-10]。胰蛋白酶的主要作用是使細胞間的蛋白質水解，從而使細胞離散，但有研究報道，胰蛋白酶可水解膠原蛋白和彈力蛋白，對組織ECM結構破壞嚴重[10]，而膠原和彈性蛋白是決定肺基質力學性能的最主要成分[11]。為了較好地保留肺組織ECM成分，本研究未使用胰蛋白酶，僅使用TritonX-100、SDS化學去垢劑，其中離子型去污劑SDS的使用被認為能減輕ECM超微結構的破壞[12]。值得注意的是利用離子型化學去垢劑去細胞后，殘存的去垢劑會產生細胞毒性[13]，因此需將制備的去細胞肺支架反復用去離子水及PBS液沖洗干凈。另外，理想的去細胞生物支架除保留關鍵的ECM功能組分外，也應除盡富含DNA的核酸成分[14]。文獻報道，去細胞支架DNA濃度小于50 ng/mg（干重），DAPI免疫熒光染色或HE染色未見明顯細胞核結構，可有效防止移植后的免疫排斥反應[15]，但大多數方法制備的肺去細胞支架上仍保留殘存的細胞質、細胞核等成分[16]。本課題組制備的全肺去細胞支架經HE染色、免疫熒光染色等鑒定，結果表明能較完全地去除肺組織細胞及細胞核結構，同時較完整地保留ECM主要成分（彈性蛋白、LN、IV型膠原等）。組織工程肺構建的另一關鍵點是肺血管網絡的重建，這需要制備的肺去細胞生物支架具備完整的肺血管三維空間結構，以便組織工程肺能更好地參與血液運輸和氣體交換[17]。通過血管鑄型實驗表明，去細胞后的肺支架血管網絡結構保留完整，肉眼觀察與正常肺血管網絡結構相仿。

本研究制備全肺去細胞支架的方法簡便易行，且成本低，是一種較理想的制備組織工程肺生物支架材料的方法，為將來進一步制備替代移植肺的生物學功能材料提供實驗基礎。

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（本文編輯：吳彬）

Preparation and identification of a whole lung decellularized scaffold

CHEN Chan1,WANG Zhibin2,WENG Jie3,YU Qing4,XU Enpan4,CHEN Na4,MENG Zhuo4,DU Xiaohong1,CHEN Shixin2.1.Department of Geriatric Medicine,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Department of Anatomy,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 3.Department of Emergency,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027; 4.The Second Clinical Medical College,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035.

Abstract:Objective:To prepare a whole lung decellularized scaffold that was perfused with TritonX-100 and SDS,and to perform preliminary identification.Methods:Twenty SD rats were divided into two groups of 10 case in each randomly (decellularization and control group).Hearts and lungs were harvested from SD rats.In decellularization group,the arterial catheters were inserted through the aortopulmonary to establish channels for whole lung perfusion successively with heparinized PBS solution,1% TirtonX-100,0.8% SDS and deionized water in 37 ℃.The DNA concentration was determined after decellularization,and the scaffold and native lung were observed by HE staining,immunotluorescence and vascular cast.Results:Quantitative analysis of DNA content within the decellularized scaffold was (40.37±5.01) ng/mg,which showed a significant decrease compared to the native lung [(846.64±65.70) ng/mg].A lot of collagen fibers could be observed with HE and immunohistochemistry stain but no visible cell nuclei remained after decellularization.Cast specimen showed that pulmonary arteries were still full and clear compared with the native lung.Conclusion:The method of perfusion with TritonX-100 and SDS can effectively remove all cellular components,and retain the extracellular matrix and vascular network structure well.It’s a convenient and ideal preparation method on decellularized lung scaffold for tissue engineering.

Key words:decellularization; lung; extracellular matrix; tissue engineering; rats

通信作者：陳世新，教授，Email：CSX8260723@163.com。

作者簡介：陳嬋（1981-），女，浙江溫州人，主治醫師，碩士。

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（LY14H180008）；浙江省衛生廳科研基金資助項目（2014KYB153）；溫州市公益性科技計劃項目（Y20140688）。

收稿日期：2015-09-15

[中圖分類號]R322.3

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.02.003