鹿藥化學成分及其抗腫瘤活性

趙淑杰， 洪 波， 韓忠明， 楊利民

（吉林農業大學，吉林長春130118）

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鹿藥化學成分及其抗腫瘤活性

趙淑杰， 洪 波， 韓忠明， 楊利民

（吉林農業大學，吉林長春130118）

摘要:目的 研究鹿藥Smilacina jaPonica A.Gray根莖及根的的化學成分及其抗腫瘤活性。方法 鹿藥乙醇提取物采用大孔吸附樹脂、硅膠、凝膠色譜柱和重結晶等方法分離純化，根據波譜數據及理化性質鑒定所得化合物的結構。然后，MTT法考察其對人結腸癌細胞株Caco-2、人乳腺癌細胞株MCF-7、人胃癌細胞株BGC-823和人肺腺癌細胞株SPC-A1的抑制作用。結果 從中分得3個化合物，分別鑒定為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）、薯蕷皂苷（2）、（25R）-海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-［β-D-吡喃木糖基（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷（3）。其中，化合物1對SPC-A1細胞、化合物3對Caco-2和MCF-7細胞增殖有較強的抑制作用，化合物2對Caco-2細胞有抑制作用。結論 首次從鹿藥中分離得到3個甾體皂苷均具有一定的抗腫瘤活性。

關鍵詞:鹿藥；化學成分；抗腫瘤

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.022

KEY W 0RDS: Smilacina jaPonica A.Gray；chemica1constituents；anti-tumor

鹿藥Smilacina jaPonica A.Gray為百合科鹿藥屬多年生草本植物，藥食同源，地下根莖及根為民間常用中藥［1］。據考證，鹿藥始自《千金·食治》，性“甘、苦、溫，無毒”，具有補氣益腎、祛風除濕、活血調經功效［2-3］。在我國，這一野生資源分布十分廣泛，儲量巨大，因其藥食兩用價值，越來越被人們所關注［4-5］，故深入研究其藥效的物質基礎是非常必要的，也將為開發新藥源提供依據。報道顯示，從鹿藥屬植物中分離得到的成分多為甾體皂苷，具有抗真菌和抗腫瘤活性［6-7］，本課題組前期對鹿藥根莖及根的化學成分進行研究，已分離得到5個黃酮類化合物［8］，現又得到3個皂苷化合物，分別鑒定為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）、薯蕷皂苷（2）、（25R）-海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-［β-D-吡喃木糖基（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷（3），均為首次從鹿藥中分離得到。其中，化合物1和3也為首次從鹿藥屬植物中分離得到，而且3個化合物均具有一定的抑制腫瘤細胞增殖作用。

1 材料與儀器

1.1 材料 鹿藥樣品采自吉林省九臺市馬虎頭山，經吉林農業大學楊利民教授鑒定為百合科鹿藥屬植物鹿藥S.jaPonica的根莖及根，洗凈陰干，備用。

1.2 細胞株 人結腸癌細胞株Caco-2、人乳腺癌細胞株MCF-7由中國醫學科學院藥物所提供；人胃癌細胞株BGC-823、人肺腺癌細胞株SPC-A1由吉林農業大學生命科學學院提供，均按實驗室常規方法保存和培養。

1.3 儀器與試劑 DL-1000E智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；X-4數字顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司）；WWZ-2A自動旋光儀（上海科登精密儀器有限公司）；FTIR-8400S傅立葉變換紅外光譜儀（KBr壓片，日本島津公司）；Agi1ent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；AV400核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；MATLCQ電噴霧質譜儀（美國Finigan公司）。96孔細胞培養板（美國Corning Costar公司）；CO2培養箱（美國Forma Scientific公司）；超凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；TS-2脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DG5032酶聯免疫檢測儀（南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司）。新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶、噻唑藍（美國Amresco公司）；二甲基亞砜（天津市北聯精細化學品開發有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；D101大孔吸附樹脂；柱色譜及薄層色譜用硅膠（青島海洋化工有限公司）。

2 方法

2.1 提取與分離 取粉碎后的鹿藥根莖及根2.8 kg，加5倍量90％乙醇浸泡12 h后，50℃下超聲（300 W、70 kHz）提取40 min，過濾，濾渣分別加入5倍量80％、70％乙醇提取2次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得棕色浸膏。將浸膏（1 087 g）水溶后，分2次過D101大孔吸附樹脂柱（10 cm×80 cm，1.8 kg），先用蒸餾水洗脫至流出液無色，再依次用30％、50％、70％、90％乙醇洗脫，分別洗脫至流出液無色，將各洗脫部分減壓濃縮蒸干，分別得到56.87、15.93、16.32、2.23 g提取物。取70％乙醇洗脫部分12 g，干法上硅膠柱（200～300目），氯仿-甲醇梯度洗脫（9∶1→2∶8），經薄層色譜檢測，合并相同流份，得到Fr.A～Fr.G，各部分反復經硅膠、SePhadex LH-20凝膠和重結晶等方法純化。Fr.C（4.76 g）得化合物1（143 mg）；Fr.D（1.83 g）得化合物2 （34 mg）；Fr.E（2.30 g）得化合物3（73 mg）。

2.2 MTT法檢測細胞增殖 采用MTT法，測試3個鹿藥單體皂苷對腫瘤細胞增殖的影響。選對數生長期的細胞，調整細胞密度為1×104/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h，吸去培養液，加入含有藥物的培養液200 μL，設6個藥物終質量濃度組（1.25、2.5、5.0、10、20、40 μg/mL）及陰性對照組（含DMSO溶媒的培養液），另設調零組（只加培養液），每組設6個復孔，加藥后置于37℃、5％CO2培養箱中培養48 h。將含藥培養液吸去，加入體積比為4∶1的無血清培養液和MTT（終質量濃度為5 mg/mL）共100 μL，繼續孵育4 h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，放于震蕩器上震蕩以使結晶完全溶解（5 min），酶標儀在570 nm主波長、630 nm副波長下檢測各孔的吸光度（A）值。然后，計算各濃度化合物對細胞生長的抑制率，公式為細胞生長抑制率=（1 -A加藥孔/ A陰性對照）×100％，再應用SPSS軟件處理數據，將抑制率對藥物濃度作曲線，計算IC50值。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1:白色顆粒，易溶于甲醇，［α］20D= -31.8°（c=0.17，MeOH），mP 201～204℃，Libermann-Burchard反應陽性，Mo1ish反應陽性，與Ehrish試劑顯紅色，提示該化合物為呋甾皂苷。ESI-MS m/z: 977.3［M+H］+、917.3［M-59］+（即［M-AcO］+）。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ: 5.74（1H，t，J=9.6 Hz，H-12），5.18（1H，brs，H-6），4.34 （1H，t，J=6.8 Hz，H-16），3.99（1H，m，H-3），3.39、3.38（各1H，s，H-26），2.54（2H，s，H-4），2.26（3H，s，CH3C=O），2.15、1.62（1H，m；1H，s，H-7），2.14（1H，m，J=7.2 Hz，H-20），2.09（2H，m，H-15），1.95（1H，s，H-14），1.87 （2H，s，H-11），1.74、1.93（1H，s；1H，m，H-2），1.67、1.64（各1H，s，H-1），1.58、1.78（1H，s；1H，s，H-23），1.46（2H，m，H-24），1.46 （1H，m，H-25），1.39（1H，m，H-8），1.11（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-19），0.87 （1H，s，H-9），0.84（3H，s，H-18），0.57（3H，d，J=5.6 Hz，H-27），三組糖的氫信號δ: 4.78 （1H，d，J=7.6 Hz，H-1 of G1u），4.28（1H，m，H-2 of G1u），3.64（1H，d，J=9.6 Hz，H-3 of G1u），4.47（1H，m，H-4 of G1u），3.61（1H，s，H-5 of G1u，與C-5 of G1u相關較弱），4.49（1H，d，J= 3.2 Hz，H-6 of G1u）；5.40（1H，brs，H-1 of Rha），4.11（1H，m，H-2 of Rha），4.47（1H，d，J= 3.2 Hz，H-3 of Rha），5.59（1H，m，H-4 of Rha），4.67（1H，m，H-5 of Rha），1.68（3H，d，J=6.8 Hz，H-6 of Rha）；4.90（1H，d，J=7.6 Hz，H-1 of G1u26），3.82（1H，t，J=8.0 Hz，H-2 of G1u26），3.71（1H，m，H-3 of G1u26），4.03（1H，m，H-4 of G1u26），3.96（1H，m，H-5 of G1u26，與C-5 of G1u26相關較弱），4.18（2H，dd，J=4.8，5.2 Hz，H-6 of G1u26）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δ: 37.6（C-1），30.1（C-2），77.7（C-3），38.7（C-4），140.7 （C-5），122.1（C-6），32.5（C-7），32.6（C-8），50.3（C-9），37.2（C-10），21.1（C-11），76.2（C-12），45.3（C-13），53.1（C-14），31.9（C-15），90.2（C-16），90.3（C-17），17.4（C-18），19.5（C-19），44.9（C-20），9.9（C-21），109.9（C-22），32.1（C-23），28.9（C-24），30.6（C-25），66.8（C-26），17.3（C-27），21.6（CH3C=O），170.9（C= O）。三組糖的碳信號δ: 99.7，77.6，76.9，70.2，76.8，61.1（C-1～C-6 of G1u）；99.4，74.1，70.2，74.4，70.1，18.7（C-1～C-6 of Rha）；106.2，75.3，78.1，71.2，78.7，67.6（C-1～C-6 of G1u26）。根據理化性質及波譜數據，結合HMQC、HMBC和TOCSY譜，對分子中的C、H信號進行歸屬，并參考文獻［9-12］，確定化合物1為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，12，17α，22ξ，26-五醇-12-O-乙酰基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，結構見圖1。

化合物2:白色粉末，mP 186～189℃，具辛辣味，Liebermann和Mo1ish反應均呈陽性，顯示該化合物為皂苷。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ: 6.35 （1H，brs，H-1 of Rha2），5.80（1H，brs，H-1 of Rha1），5.31（1H，m，H-6），4.93（1H，d，J= 7.7 Hz，H-1 of G1u），1.04（3H，s，H-21），1.03 （3H，s，H-19），0.98（3H，d，J=5.8 Hz，H-27），0.80（3H，s，H-18）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δ: 37.6（C-1），30.2（C-2），79.0（C-3），39.9（C-4），141.0（C-5），121.9（C-6），32.3（C-7），31.8（C-8），50.4（C-9），37.6（C-10），21.2（C-11），40.2（C-12），40.6（C-13），56.8（C-14），32.4（C-15），81.2（C-16），63.0 （C-17），16.4（C-18），19.5（C-19），42.1（C-20），15.1（C-21），109.3（C-22），30.9（C-23），29.4（C-24），30.7（C-25），66.9（C-26），17.4 （C-27）。三組糖信號: 100.4，78.8，72.6，78.0，76.9，61.5（C-1～C-6 of G1u）；102.1，73.2，72.9，74.2，70.5，18.5（C-1～C-6 of Rha1）；103.0，72.6，72.8，73.9，69.6，18.7（C-1～C-6 of Rha2）。以上數據與文獻［13］報道基本一致，故鑒定化合物2為薯蕷皂苷。

化合物3:白色粉末，mP 262～264℃，Liebermann-Burchard和Mo1ish反應均呈陽性，顯示該化合物為皂苷。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）高場區有4個甲基質子信號δ: 1.35（3H，d，J=6.9 Hz，H-21），1.08（3H，s，H-18），0.70（3H，d，J= 5.4 Hz，H-27），0.66（3H，s，H-19）；低場區有4個糖端基質子信號δ: 5.57（1H，d，J=7.3 Hz，H-1 of Xy1），5.23（1H，d，J=7.7 Hz，H-1 of G1u1），5.18（1H，d，J=7.9 Hz，H-1 of G1u2），4.85（1H，d，J=7.7 Hz，H-1 of Ga1）；26位2個氫信號δ: 3.59（1H，dd，J=10.5，2.3 Hz，H-26a），3.49（1H，dd，J=10.5，10.5 Hz，H-26b），兩者無顯著差異，顯示為25R型螺甾皂苷［9］。13CNMR（100 MHz，C5D5N）δ: 36.7（C-1），29.7 （C-2），77.2（C-3），34.7（C-4），44.5（C-5），28.6（C-6），31.5（C-7），34.4（C-8），55.4（C-9），36.3（C-10），38.0（C-11），212.7（C-12），55.6（C-13），56.0（C-14），31.9（C-15），79.7 （C-16），54.4（C-17），16.1（C-18），11.8（C-19），42.7（C-20），13.9（C-21），109.3（C-22），31.7（C-23），29.3（C-24），30.6（C-25），67.0 （C-26），17.3（C-27）。四組糖信號δ: 102.5，73.2，75.7，79.9，75.4，60.7（C-1～C-6 of Ga1）；104.8，81.3，87.0，71.2，77.6，63.0（C-1～C-6 of G1u1）；105.1，75.1，78.7，70.8，67.4（C-1～C-5 of Xy1）；105.0，76.2，78.7，70.5，77.8，62.6（C-1～C-6 of G1u2）。以上數據與文獻［12，14］基本一致，故鑒定化合物3為（25R）-海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-［β-D-吡喃木糖基（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷。

3.2 鹿藥皂苷對細胞增殖的影響(表1) 化合物1對乳腺癌細胞MCF-7和肺腺癌細胞SPC-A1增殖具有抑制作用，而且隨質量濃度增大，抑制率也增大，IC50分別為14.87和7.67 μg/mL，可見其對SPC-A1有較強的抑制作用；化合物2只對結腸癌細胞Caco-2有抑制作用；化合物3對Caco-2和MCF-7增殖均有較強的抑制作用。綜上所述，鹿藥中分離得到的幾個甾體皂苷對腫瘤細胞均有一定的抑制活性。

表1　化合物對腫瘤細胞的抑制作用Tab.1 Inhlbltory effects of com pounds on tum or cells

4 結論

在目前治療癌癥、心腦血管疾病、糖尿病等高發疾病的藥物方面，天然藥物扮演著非常重要的角色。據統計，從1981年到2008年間已上市的抗腫瘤藥物中，有62.9％來自天然產物或其衍生物，因此從天然產物（特別是藥用植物）中尋找治療和預防疾病的安全有效的生物活性成分，并開發成新藥，已成為當前藥學及化學領域中研究的熱點。本實驗結果顯示，從鹿藥中分離得到的甾體皂苷可能具有抗腫瘤活性，對揭示其藥用價值的物質基礎具有重要意義，也為抗腫瘤的天然藥物篩選提供依據，值得進一步深入探究。

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Chem lcal constltuents and thelr antl-tumor actlvltles of Smilacina japonica

ZHAO Shu-jie， HONG Bo， HAN Zhong-ming， YANG Li-min
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

ABSTRACT:AIM To study the chemica1 constituents and their anti-tumor activities of rhizomes and roots of Smilacina jaPonica A.Gray.METH0 DS The iso1ation and Purification of S.jaPonica ethano1ic extractwere Performed on macroPorous resin，si1ica，SePhadex LH-20 ge1 chromatograPhy and recrysta11ization.The structures of obtained comPounds were e1ucidated based on sPectra1 data and Physicochemica1ProPerties.Then the inhibition effects of them on human co1on cancer Caco-2，human breast cancer MCF-7，human gastric cancer BGC823 and human 1ung adenocarcinoma SPC-A1 ce111ineswere investigated by MTTmethod.RESULTS Three comPounds were iso1ated and identified as26-O-β-D-g1ucoPyranosy1-（25R）-furost-5-en-3β，12，17α，22ξ，26-Pento1-12-O-acety1e-3-O-α-L-rhamnoPyranosy1-（1→2）-β-D-g1ucoPyranoside（1），dioscin（2）and（25R）-hecogenin saPonin 3-O-β-D-g1ucoPyranosy1（1→2）-［β-D-xy1oPyranosy1（1→3）］-β-D-g1ucoPyranosy1（1→4）-β-D-ga1actoPyranoside（3）.Among them，comPound 1 showed a strong inhibitory effect on the growth of human 1ung adenocarcinoma SPC-A1 ce11，comPound 3 showed strong inhibitory effects on the growth of human co1on cancer Caco-2 and human breast cancer MCF-7 ce11s，and comPound 2 showed a inhibitory effect on human co1on cancer Caco-2 ce11.C0 NCLUSI0 N Three comPounds iso1ated from this P1ant for the first time have anti-cancer effects.

作者簡介:趙淑杰（1976—），女，博士，副教授，研究方向為天然產物化學。Te1:（0431）84532955，E-mai1: zhsj1ong@163.com

基金項目:吉林省自然科學基金項目（20140101128JC）

收稿日期:2015-04-01

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0332-04