豬圓環病毒2型LAMP可視化快速檢測方法的研究

胡瑞麗，倪建平，趙 笑，趙 慶，史 斌，趙桓震，趙斌安，趙 凱

（1上海師范大學，上海200234；2上海市農業科學院生物技術研究所，上海201106；3上海佳牧生物制品有限公司，上海201106；4寧夏大學，銀川750021；5上海斯高勒生物科技有限公司，上海200233；6上海珺玨生物科技有限公司，上海201501；7上海博滿生物科技有限公司，上海201106；8上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海201106）

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豬圓環病毒2型LAMP可視化快速檢測方法的研究

胡瑞麗1，倪建平2，3*，趙 笑4，趙 慶5，史 斌5，趙桓震6，趙斌安7，趙 凱2，8**

（1上海師范大學，上海200234；2上海市農業科學院生物技術研究所，上海201106；3上海佳牧生物制品有限公司，上海201106；4寧夏大學，銀川750021；5上海斯高勒生物科技有限公司，上海200233；6上海珺玨生物科技有限公司，上海201501；7上海博滿生物科技有限公司，上海201106；
8上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海201106）

摘 要：本研究旨在建立有效的針對豬圓環病毒2型（PCV2）的診斷技術及開發試劑盒。采用環介導等溫擴增方法（LAMP）檢測豬圓環病毒2型（PCV2），對PCV2的ORF2基因設計出3對特異性引物，擴增PCV2基因的最佳溫度和時間優化到59℃孵育55 min。用該方法對臨床樣品進行檢測，LAMP檢測對PCV2的檢測限為10拷貝/μL，而常規PCR檢測法的檢測限為1 000拷貝/μL，表明LAMP檢測法靈敏度高。該檢測法不會與豬圓環病毒Ⅰ型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎的豬病毒和輪狀病毒發生交叉反應。用建立起的LAMP檢測法對1 100個臨床樣品進行檢測，950個樣品被檢測出為陽性樣品。穩定性試驗表明該試劑盒可以耐受至少40次的反復凍融。結果顯示，該方法建立的豬圓環病毒2型診斷方法靈敏度高，特異性強，穩定性好。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；環介導等溫擴增；檢測；診斷試劑盒

**通信作者，E-mail：kzhao118＠163" com

斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）是由豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）引起的一種重要疾病，嚴重發病地區死亡率高達40％以上，殘存下來的病豬也極少康復。由于PCV2嚴重破壞豬的免疫系統，導致各種疫苗接種應答效果差，免疫失敗，并且誘發其他疾病暴發［1-3］，例如，PCV2還與豬的傳染性先天性震顫、肉芽腫性腸炎、皮炎與腎病綜合征、豬呼吸綜合征、豬繁殖障礙、滲出性表皮炎和壞死性淋巴結炎等疾病有相關性［4］；因此，PCV2感染的早期診斷成為PMWS防治的新的策略，有必要開發出一種豬PCV2的定性、定量快速檢測方法用于PMWS的防控。

目前，PCV2的診斷主要依靠免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術。由于免疫學技術自身敏感性和特異性較差，因此分子生物學檢測技術得到了迅速的發展。1）PCR技術是一種常規的分子生物學檢測技術，其中常規PCR方法是常用的［5］，然而，在用PCR對生物樣品進行檢測分析中，由于存在PCR抑制劑，這使PCR的有效性受到了抑制［6-7］；2）ELISA檢測：由于抗原抗體反應的專一性，每種基因產品都要開發和建立專門的檢測試劑和方法，要建立所有基因產品的蛋白質檢測法工作量很大［8-9］；3）基因芯片檢測不僅需要昂貴的芯片制作系統，操作復雜、費時，對操作人員的專業素質要求比較高，容易造成樣品污染。此外，實時定量PCR是定性和定量分析PCV2［10-13］較好的檢測方法，然而，這種檢測方法對實驗人員的要求很高而且需要昂貴的專業儀器；因此，快速、靈敏并且易于操作的現場檢測PCV2方法成為獸醫臨床的迫切需求。

環介導等溫擴增方法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等［14］發明的一種新型的等溫核酸擴增技術。它具有快速高效、靈敏度高、特異性強、操作簡便、無需昂貴的擴增設備、結果鑒定直觀等特點，非常適合臨床檢測和大規模檢疫工作。環介導等溫擴增較其他核酸擴增方法具有特異性，選擇性，快速的特點［15］。通過使用前部環形引物［16］改進環介導等溫擴增方法，該方法在醫院實驗室中快速診斷和在食源性病原微生物［17］的快速檢測中是較效的工具。已有報道Chen等［18］使用環介導等溫擴增方法來檢測豬圓環病毒2型。在他們的研究中，只有4個引物且沒有添加甜菜堿。本研究中，包含1對環形引物在內的6個引物對PCV2的不同區域進行擴增，補充和擴展了以前的PCV2 LAMP檢測方法；本研究的目的是用于PCV2的LAMP檢測，方法要具有高特異性，高靈敏度，快速且簡單易行的特點。

1 材料與方法

1．1 病毒來源

豬圓環病毒2型（PCV2）、豬圓環病毒Ⅰ型（PCV1）、豬細小毒病毒（PPV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、輪狀病毒（RV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株均由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所提供，所有的這些毒株用于LAMP檢測。

1．2 引物

基于PCV2（BJ0804株）ORF2基因（GenBank登錄號：EU921257" 1），按照環介導等溫擴增引物設計說明書PrimerExplorer V3，利用網頁軟件（http：//primerexplorer" jp/elamp3" 0" 0/index" html）設計出6個LAMP引物，分別是FIP、BIP、F3、B3，此外還添加了1對環形引物LF和LB。其中的引物F3和B3還可以用于常規PCR反應中，其靶序列長度為233 bp。設計的引物如表1。

1．3 主要試劑

Bst DNA PoLymerase、MgSO4為紐英倫（NEB）生物技術（北京）有限公司產品，Betaine（B2629）為Sigma公司產品，SYBR GreenⅠ為晶美生物工程有限公司產品。

1．4 病毒核酸的提取及鑒定

利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA/RNA病毒基因組提取試劑盒（離心柱法）對DNA和RNA病毒基因組進行了提取和純化。最后加入20—35 μL DEPC水到吸附柱中，12 000 r/min離心1 min。將純化得到的DNA/RNA保存在－20℃。純化得到的RNA進行反轉錄。在20 μL反轉錄體系加入Template RNA（poly（A）＋RNA）、5×1st Strand Synthesis Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18或Random Primer、Reverse Transcriptase（M-MLV）（200 U/μL）和RNase-free H2O，室溫放置10 min后，放至42℃恒溫水浴鍋內反應1 h，反應結束后置于冰中冷卻2 min。

1．5 病毒標準陽性質粒模板的制備

以豬圓環病毒2型BJ0804株為標準模板，F3和B3為上下游引物，按照PCR體系進行擴增，PCR反應體系為25 μL體積包含：ddH2O 16" 5 μL，10×PCR buffer 2" 5 μL，dNTP 2" 0 μL，F3 1" 0 μL，B3 1" 0 μL，Taq ploymerase（Takara Corp"）1" 0 μL，1" 0 μL提取的DNA。反應程序：95℃預變性5 min，進入PCR反應循環：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環，最后72℃總延伸5 min。

PCR產物的回收與純化按照Omega公司E" Z" N" A" GelExtractionKit說明書進行。回收產物與載體連接反應參照pMD18-T vector的使用說明進行。連接產物轉化感受態細胞。采用菌落PCR法篩選陽性重組質粒。參照3S Spin Plasmid Miniprep Kit V3" 1的說明書小量制備質粒，并測其濃度，按照病毒學方法計算對應的拷貝數濃度，－20℃保存備用。

1．6 PCV2 LAMP檢測方法的建立

根據引物Tm值，對LAMP反應溫度（55—60℃）進行優化，從多次重復試驗中確定最佳退火溫度。反應時間按30 min、45 min、60 min、90 min、120 min優化，多次重復試驗確定最佳反應時間。

據反應體系優化策略，對MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、3對引物等成分分別進行了優化。MgSO4（100 nmol/μL）的體積按0"6 μL、0"8 μL、1"0 μL、1" 2 μL依次遞增。Betaine（5 μmol/μL）的體積按3 μL、4 μL、5 μL、6 μL依次遞增。Bst DNA PoLymerase（8 U/μL）體積按0"6 μL、0"8 μL、1"0 μL、1"2 μL依次遞增。dNTP（25 mmol/μL）體積按3 μL、4 μL、5 μL、6 μL依次遞增。3對引物（FIP/BIP∶F3/B3∶LF/LB）按1∶2∶2、1∶4∶4、2∶1∶2、1∶1∶2、4∶1∶4、4∶2∶1、4∶4∶1通過正交試驗進行優化，確定最佳反應體系。

1．7 PCV2 LAMP可視化試驗

LAMP反應結束后，加入1 μL熒光染料SYBR Green I熒光染料，觀察陰性和陽性反應體系顏色的變化情況。

1．8 LAMP檢測豬圓環病毒2型靈敏度的試驗

取豬圓環病毒2型質粒倍比稀釋，采用優化的反應體系和反應條件，檢測所建立LAMP方法的靈敏度，可視化觀察反應情況：反應結束后，加入1 μL熒光染料SYBR Green I，觀察陰性和陽性反應體系顏色的變化情況。

1．9 LAMP檢測豬圓環病毒2型特異性試驗

檢測豬圓環病毒2型特異性試驗分別以CSFV病毒、PRRSV病毒、PRV病毒作為樣品，同時設立陰性對照，采用上面優化的反應體系和反應條件，檢測所建立LAMP方法的特異性。

1．10 LAMP檢測豬圓環病毒2型穩定性試驗

將上述試劑盒貯存于－20℃，在該溫度和室溫下反復凍融10次、20次、30次和40次后，觀察結果。

1．11 PCV2 LAMP可視化快速檢測試劑盒的應用

委托上海博滿生物科技有限公司、上海斯高勒生物科技有限公司、上海珺玨生物科技有限公司在江蘇省、浙江省、上海市畜牧養殖場進行了推廣應用。

2 結果與分析

2．1 ORF2基因的PCR擴增

PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析表明，擴增出了與ORF2相應的約223 bp大小的特異片段，與預期結果相符。

2．2 重組質粒的篩選

PCR擴增產物經回收純化后，與克隆載體pMD18-2T連接轉化，然后挑取單個的菌落做擴大培養，以擴大培養的菌液為模板，F3和B3為引物分別做菌液PCR鑒定，擴增出約為223 bp大小的特異性條帶，結果和預期擴增的片段大小相符。

2．3 優化的LAMP反應體系和反應條件

經過對LAMP反應時間和反應溫度分別進行調整，反應條件為59℃45 min。

利用上述優化出的最佳反應溫度和反應時間先對MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP成分進行優化，確定最佳反應體系為MgSO41" 2 μL、Betaine 4" 0 μL、Bst DNA PoLymerase 1" 0 μL、dNTP 3" 0 μL。最后用優化好的體系和反應溫度，反應時間對引物進行優化，確定出最佳引物比例組合FIP/BIP∶F3/B3∶LF/LB為4∶1∶4。

2．4 PCV2 LAMP反應可視化結果的判定

反應結束后，加入1 μL SYBR GreenⅠ熒光染料，陽性反應管顏色變為綠色，陰性反應管不發生顏色變化，為橘紅色，由此可見LAMP反應結果易判定（圖1），易于臨床推廣。

圖1　PCV2 LAMP反應可視化結果Fig．1 Visual result of LAMP reaction for detection of PCV2

2．5 LAMP反應的靈敏度

對PCV2質粒按10倍梯度稀釋成以下6組濃度的樣品（拷貝/μL）：100，101，102，103，104，105，106。進行3次重復性試驗，結果在101—106拷貝樣品均有明顯綠色，最低DNA濃度為PCV2質粒101拷貝，即建立的PCV2的LAMP檢測下限為101拷貝。該方法能在1 h內報告樣品的檢測結果。PCV2的LAMP檢測方法靈敏度檢測結果圖2。

2．6 LAMP特異性試驗

PCV2的LAMP檢測方法特異性檢測結果見圖3。所有供試PCV2樣品和陽性對照中顏色反應均為綠色，而在CSFV、PRRSV、PRV樣品中顏色反應均為橘色，說明引物特異于PCV2樣品檢測。該方法能在1 h內報告樣品的檢測結果。

注：3次重復性試驗；01—07：梯度稀釋的PCV2 DNA質粒1拷貝/μL，101拷貝/μL，102拷貝/μL，103拷貝/μL，104拷貝/μL，105拷貝/μL和106拷貝/μL；08：陰性對照圖2　PCV2 LAMP檢測法靈敏度Fig．2 Sensitiveness of LAMP detection of PCV2

注：3次重復性試驗；第1列：PCV2質粒；第2列：PCV2病毒樣品；第3列：CSFV病毒樣品；第4列：PRRSV病毒樣品；第5列：PRV病毒樣品；第6列：陰性對照圖3　PCV2基因LAMP法檢測的特異性Fig．3 Specificity of LAMP reaction for detection of PCV2 gene

2．7 LAMP穩定性試驗

該試劑盒可以耐受至少40次的反復凍融，擁有較好的穩定性。

2．8 豬圓環病毒2型臨床樣品檢測

用該LAMP試劑盒檢測1 100個血清樣品，看是否感染PCV2。結果檢出其中有950個臨床樣品感染PCV2。

3 結論與討論

目前已有關于PCV2 LAMP檢測方法的報道，何逸民等［19］、史利軍等［20］均做了PCV2的LAMP檢測方法的研究。成熟的LAMP檢測法對PCV2檢測是特異性的，其他的病毒沒有擴增產物。根據PCR和LAMP引物設計的結果得知PCV2的ORF2基因具有較高的特異性。LAMP檢測法對靶序列具有高特異性是因為在起始階段，6個獨立序列（F1c，F2，F3，B1c，B2和B3）能識別靶序列［21］，之前顯示4個獨立序列（F1c，F2，B1c和B2）在稍后階段擴增靶序列，而常規PCR檢測法只有1對引物去識別靶序列。與之前的研究最大的不同在于本研究中加入了1對環形引物，可使反應速度提高1/3到1/2。

優化后的PCV2 LAMP檢測方法的檢測限為10個拷貝，比常規的PCR檢測方法靈敏很多。LAMP檢測的靈敏度與之前報道的檢測其他病毒的靈敏度是一樣的，例如豬傳染性胃腸炎冠狀病毒，H5禽流感病毒，黃頭病毒［22-24］。當LAMP檢測開始時，需要一些措施來防止假陽性的出現。盡管LAMP檢測方法對檢測PCV2臨床樣品是一個有效的方法，但是在LAMP檢測方法中實驗室污染是一個容易出現的問題。對于臨床樣品檢測，DNA提取步驟可以省略，血清樣品也可直接用于LAMP反應中。與常規PCR檢測法相比，LAMP檢測法的靈敏度受到臨床樣品中的各種物質影響較小。在LAMP檢測法中，這減少了時間、降低了試驗成本并簡化了很多繁瑣的步驟。最重要的是LAMP檢測法對各種物質的超強耐受性使得該方法在小型醫院，實驗室，私人診所和養殖場普及成為可能。

在基于LAMP技術的豬PCV2現場可視化定性快速檢測方法中，優化之后的LAMP檢測法能對PCV2進行可視化、現場快速檢測。與常規的PCR檢測方法相比，LAMP檢測法具有省時、低成本和易于操作等優點。與他人建立的PCV2 LAMP檢測方法相比，LAMP反應體系中添加了甜菜堿，可以加快解鏈速度。在引物中增加了環形引物，可使LAMP反應時間減少一半。另外，不用提取樣品中的PCV2病毒DNA，可直接將豬血清作為模板進行LAMP反應，因為LAMP檢測法對生物樣品的耐受性要優于其他檢測方法，故在LAMP中可以省去DNA提取步驟［25］。儀器設備簡單，只需1臺水浴鍋，兩把移液器、1臺掌式離心機、1臺漩渦振蕩器，不需要PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀，養殖戶只需花費1000多元錢就可以添置進行LAMP操作的所有設備，耗材便宜，不需提取樣品中的PCV2病毒DNA，直接將豬血清作為模板進行LAMP反應，避免了DNA抽提試劑盒的使用，降低了成本；易于操作，一般人員只需稍加訓練就可操作，所需時間少，于1 h內就可完成試驗。因此養殖戶自己可以進行現場可視化快速檢測PCV2。

參 考 文 獻

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（責任編輯：程智強）

Visual rapid detection of porcine circovirus type 2 by a loop-mediated isothermal amplification assay

HU Rui-li1，NI Jian-ping2，3*，ZHAO Xiao4，ZHAO Qing5，SHI Bin5，ZHAO Huan-zhen6，ZHAO Bin-an7，ZHAO Kai2，8**（1Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai 201106，China；4Ningxia University，Yinchuan 750021，China；5Shanghai Scholar Biotech Company Limited，Shanghai 200233，China；6Shanghai Junjue Biotech Company Limited，Shanghai 201501，China；7Shanghai Bio-Full Biotech Company Limited，Shanghai 201106，China；8Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201106，China）

Abstract：In order to establish effective diagnostic technique and diagnostic kit for porcine circovirus type 2 （PCV2），a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay was used to detect PCV2，three pairs of specific primers were designed for PCV2’s ORF2 gene，and the time and temperature conditions for amplification of PCV2 gene were optimized to be 55 min at 59℃" Testing clinical samples by this method showed that the detection limit for PCV2 was 10 copies/μL，whereas the conventional PCR detection limit was 1 000 copies/μL，indicating that the LAMP method was highly sensitive" The detection did not cross-react with PCV1，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，porcine epidemic diarrhea virus，transmissible gastroenteritis’pig virus and rotavirus" When 1 100 samples were tested by the established LAMP method，950 samples were detected to be positive" The stability test showed that this kit could endure at least 40-time reiterative freeze-thaw" The above results indicated that thebook=24,ebook=29established method and diagnostic kit had high sensitiveness，strong specificity and good stability"

Key words：Porcine circovirus type 2；Loop-mediated isothermal amplification；Detection；Diagnostic kit

作者簡介：胡瑞麗（1989—），女，在讀碩士，研究方向：基因工程。E-mail：hrly524＠163" com；Tel：021-62203047

基金項目：上海市閔行區重大產業化專項（2014MH076）

收稿日期：2015-12-28

文章編號：1000-3924（2016）01-023-06

中圖分類號：S852" 65

文獻標識碼：A

*并列第一作者：倪建平（1963—），男，研究員，研究方向：畜牧獸醫。E-mail：nijianping＠126" com；Tel：021-37195863