液相色譜串聯質譜法檢測有機肥中4種氟喹諾酮類抗菌藥

饒欽雄，趙 晶，2，閔 紅，邵 婷，4，孫明星，羅 峰，姚春霞

（1上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海201403；2華東師范大學地理科學學院，上海200241；3上海出入境檢驗檢疫局，上海200135；4安徽師范大學環境科學與工程學院，蕪湖241003；5上海市崇明縣動物疫病預防控制中心，上海202150）

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液相色譜串聯質譜法檢測有機肥中4種氟喹諾酮類抗菌藥

饒欽雄1，趙 晶1，2，閔 紅3，邵 婷1，4，孫明星3，羅 峰5，姚春霞*

（1上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海201403；2華東師范大學地理科學學院，上海200241；3上海出入境檢驗檢疫局，上海200135；4安徽師范大學環境科學與工程學院，蕪湖241003；5上海市崇明縣動物疫病預防控制中心，上海202150）

摘 要：建立了有機肥中4種氟喹諾酮類抗菌藥的液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）分析方法。取5 g有機肥樣品以5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH＝4" 0）與20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V）超聲提取兩次，用HLB固相萃取柱進行凈化富集，以5％氨化甲醇進行洗脫，氮氣吹干后以溶液（三乙胺＋磷酸＋水＝0" 66＋0" 74＋100）＋乙腈＝88＋12（V/V）復溶。以0" 1％甲酸水和甲醇作為流動相，采用梯度洗脫方式LC-MS/MS檢測。試驗結果表明，有機肥中4種喹諾酮類化合物不同濃度加標回收率在66" 19％—115" 00％，相對標準偏差在2" 40％—9" 45％，檢出限為0" 010 mg/kg，定量限為0" 050 mg/kg，本方法能夠滿足實際有機肥樣品的測定要求。

關鍵詞：有機肥；氟喹諾酮類；檢測方法；液相色譜串聯質譜；提取劑

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，FQs）作為一類人工合成高效、廣譜抗菌藥在規模化畜禽養殖中大量使用，但其基本不能被動物吸收，大部分以藥物原形或其代謝物隨糞尿排出，成為環境中抗菌藥污染的重要來源［1］。污染的有機肥料廣泛施用于農業生產中，影響土壤肥力、危及農產品質量安全［2］，還可通過地表徑流和淋濾作用造成水體的污染，并引發細菌耐藥性，進而威脅動物與人類健康；因此，這類抗菌藥已成為重要環境有機污染物和環境科學研究的熱點［3］。近年來，多數科研者已用高效液相色譜法進行有機肥中獸藥殘留的檢測，就目前報道的方法而言，有機肥中獸藥殘留檢測回收率較低，檢測方法復雜［4-5］。本試驗嘗試用液相色譜串聯質譜法同時檢測有機肥中4種常見氟喹諾酮類抗菌藥：諾氟沙（NOR）、環丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、恩諾沙星（ENR）。以期為有機肥中喹諾酮類的檢測分析及風險評價提供參考依據。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

樣品的采集：樣品為雞糞和豬糞，按照GB/T 8571規定制備實驗室樣品。樣品烘干研磨后過1 mm或2 mm試驗篩。

藥品和試劑：諾氟沙星（NOR）、環丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）標準品；Na2EDTAMcllvaline緩沖液（pH 4" 0）：0" 1 mol/L檸檬酸溶液∶0" 2 mol/L磷酸二氫鈉溶液＝1000∶625（V/V）；復溶液：（三乙胺＋磷酸＋水＝0" 66＋0" 74＋100）（體積比）∶乙腈＝88∶12（V/V）；甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純。

主要儀器：液相色譜串聯質譜（Thermo，Quantum Ultra）；固相萃取裝置（WATERS）。親水親脂平衡萃取柱（HLB）（200 mg，6 mL）；離心機；超聲儀；氮吹儀。

1．2 液相色譜串聯質譜參考條件

液相色譜工作條件：C18柱（100 mm×3" 0 mm（i" d），2" 7 μm）；流動相：A相為0" 1％甲酸水溶液，B相為甲醇；梯度洗脫：梯度洗脫程序見表1；流速：0" 3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5 μL。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質譜參考條件：離子源，電噴霧離子源；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應監測；電離電壓，4" 0 kV；源溫，300℃；毛細管溫度，350℃；輔氣流速，20 L/h；鞘氣流速，30 L/h；測試藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2　氟喹諾酮類抗菌藥的定性定量離子及錐孔電壓、碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ions，cone voltage and collision energy of fluoroquinolones

1．3 樣品前處理

稱取（5" 0±0" 02）g試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液（pH 4" 0），渦動混勻，再加入20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V），渦動2 min，超聲10 min。4 500 r/min離心10 min，轉移上清液至50 mL容量瓶中，殘渣再加入上述提取劑重復提取1次。合并兩次提取液，用乙腈定容至刻度，搖勻。準確量取10 mL提取液，置于50℃水浴中氮氣吹至液面低于0" 5 mL（不能吹干），再加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液（pH 4" 0）混勻待凈化。

HLB固相萃取柱使用前用5 mL甲醇和5 mL純水活化，將上述待凈化液以2—3 mL/min的速度過柱，棄去濾液，用6 mL 30％甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干（5—10 min），再用6 mL 5％氨化甲醇洗脫，并收集洗脫液氮氣吹干，用1 mL復溶液溶解，渦動混勻，過0" 22 μm濾膜待測。

2 結果與分析

2．1 色譜分析圖

在本研究建立的儀器條件下，4種氟喹諾酮類標準品的色譜峰十分尖銳（圖1—4），并且均在4 min內完成出峰，說明構建的LC-MS/MS檢測方法能同時較好地檢測出4種氟喹諾酮類抗菌藥。

圖1　諾氟沙星色譜圖Fig．1 Chromatogram of norfloxacin

圖2　氧氟沙星色譜圖Fig．2 Chromatogram of ofloxacin

圖3　環丙沙星色譜圖Fig．3 Chromatogram of ciprofloxacin

圖4　恩諾沙星色譜圖Fig．4 Chromatogram of enrofloxacin

2．2 提取劑的選擇

比較了4種提取劑A：Na2EDTA-Mcllvaine（25 mL），B：乙腈＋乙酸＝9＋1（V/V，25 mL），C：乙腈溶液（含1％草酸）（25 mL），D：A＋B混合液（5 mL＋20 mL），提取有機肥中氟喹諾酮類抗菌藥的加標回收率（表3）。結果顯示D方案加5 mL Na2EDTA-Mcllvaine浸潤，后加20 mL乙腈＋乙酸＝9＋1（V/V）兩次重復提取有機肥中氟喹諾酮時，4種物質的回收率均能達到80％左右，并且重現性較好。故本試驗最終采用D作為有機肥中4種氟喹諾酮類抗菌藥的最佳提取劑。

2．3 線性范圍及檢出限

配制質量濃度為0"010 μg/mL、0"025 μg/mL、0"050 μg/mL、0"100 μg/mL、0"150 μg/mL及0"250 μg/mL的系列基質匹配標準溶液，液相色譜-串聯質譜儀測定。以定量離子的峰面積為縱坐標，標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線，氧氟沙星標準曲線：Y＝7587" 19X，R2＝0" 9999；諾氟沙星標準曲線：Y＝635" 51X，R2＝0" 9999；環丙沙星標準曲線：Y＝3317" 49X，R2＝0" 9998；恩諾沙星標準曲線：Y＝6030" 96X，R2＝0" 9998。在空白有機肥中添加4種氟喹諾酮標準品，多次低水平添加，以3倍信噪比作為檢出限，10倍信噪比作為定量限，結果顯示4種氟喹諾酮化合物在有機肥中的檢出限為0" 010 mg/kg （S/N≥3），定量限為0" 050 mg/kg。

表3　不同提取劑下有機肥中4種氟喹諾酮類抗菌藥的回收率Table 3 Recovery rates of 4 fluoroquinolones in manure under different extractants

2．4 樣品的加標回收率及準確度

取雞糞及豬糞2種有機肥樣品作為空白基質做添加回收試驗。我國尚未對有機肥中氟喹諾酮類規定最高殘留限量（MRL），但肉類食品中的MRL為0" 1—0" 3 mg/kg，以肉類食品的MRL為參考標準，設置了0" 1 mg/kg、0" 5 mg/kg、1" 0 mg/kg三個水平進行添加回收試驗。在雞糞和豬糞兩種基質的有機肥中氟喹諾酮類化合物的平均回收率在66" 19％—115" 00％，相對標準偏差在2" 40％—9" 45％。

2．5 精密度

以空白有機肥試樣作為基質，進行0" 1 mg/kg、0" 5 mg/kg和1" 0 mg/kg三個添加水平，每個水平重復5個樣品，按照上述樣品處理方式操作，按外標法計算回收率，以測定結果計算日內變異系數，3天內進行3批處理，以計算日間變異系數。結果表明在此方法下有機肥中喹諾酮類抗菌藥的日內變異系數和日間變異系數均小于14％。

2．6 實際樣品分析

市場上收集了9個有機肥樣品，用建立的檢測方法對其中喹諾酮類化合物含量進行檢測（表4）。結果顯示，在有機肥樣品中，氟喹諾酮類藥物均有殘留。參照肉類中的氟喹諾酮類的最高殘留量可知，1號和2號樣品中諾氟沙星，3號樣品中氧氟沙星，4號樣品中除諾氟沙星外殘留均很嚴重，超過MRL規定值，其余樣品中4種氟喹諾酮類抗菌藥均小于0" 3 mg/kg，但仍有殘留，說明該方法能有效用于檢測有機肥中氟喹諾酮類的殘留。

表4　有機肥樣品中4種氟喹諾酮類殘留含量Table 4 Contents of four fluoroquinolones in manure samples　mg·kg－1

3 討論與結論

本研究建立了LC-MS/MS測定有機肥中4種氟喹諾酮類抗菌藥的方法。以往研究多用液相色譜進行檢測，如張敏等［6］運用高效液相色譜-熒光方法檢測畜禽糞中4種氟喹諾酮類抗菌藥殘留，胡獻剛等［7］運用固相萃取-高效液相色譜法測定畜牧糞便中13種抗生素藥物殘留，該方法也具有一定的穩定性和重現性，但本研究建立的檢測方法前處理較之簡單方便，且該法進樣量少，靈敏度更高。用5 mL Na2EDTAMcllvaline和20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V）溶液提取有機肥中殘留目標物，得到較好的提取效果，HLB固相萃取柱凈化，具有良好的凈化效果。

通過對該方法回收率、精密度、準確度等的研究，表明該方法具有較高的準確度和精密度，可為定性和定量分析有機肥中氟喹諾酮類抗菌藥提供一種準確、高效的檢測方法。但該方法目前局限于4種氟喹諾酮類抗菌藥的檢測，對于其他種類獸藥的檢測尚不明確，可進一步探討優化該方法用于檢測其他獸藥的殘留。

參 考 文 獻

［1］李彥文，莫測輝，趙娜，等"高效液相色譜法測定水和土壤中的磺胺類抗生素［J］"分析化學，2008，36（7）：954-958"

［2］吳小蓮，向壘，莫測輝，等"超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜測定蔬菜中喹諾酮類抗生素［J］"分析化學，2013，41（6）：876-881"

［3］邰義萍，莫測輝，李彥文，等"長期施用糞肥土壤中喹諾酮類抗生素的含量［J］"中國環境科學，2010，30（6）：328-332"

［4］王冉，劉鐵錚，魏瑞成"豬糞便中獸藥鹽霉素殘留的降解動態研究［J］"農業環境科學學報，2007，26（S1）：219-223"

［5］田野，劉善江"有機肥料中抗生素在農田土壤和植物間的遷移研究［J］"安徽農業科學，2012，40（8）：4523-4525"

［6］張敏，劉慶玉，敖永華"高效液相色譜-熒光檢測畜禽糞污中四種氟喹諾酮類抗生素殘留［J］"湖北農業科學，2012，51（3）：602-604"

［7］胡獻剛，羅義，周啟星，等"固相萃取-高效液相色譜法測定畜牧糞便中13種抗生素藥物殘留［J］"分析化學，2008，36（9）：1162-1166"

（責任編輯：程智強）

Determination of four fluoroquinolones in manure by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

RAO Qin-xiong1，ZHAO Jing1，2，MIN Hong3，SHAO Ting1，4，SUN Ming-xing3，LUO Feng5，YAO Chun-xia1*
（1Institute for Agro-Food Quality Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2School of Geography，East China Normal University，Shanghai 200241，China；3Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China；4College of Environmental Science and Engineering，Anhui Normal University，Wuhu 241003，China；5Animal Epidemic Disease Control Center of Chongming County，Shanghai 202150，China）

Abstract：A method of determining 4 fluoroquinolones in manure was developed by liquid chromatographytandem mass spectrometry（LC-MS/MS）" A manure sample（5" 0 g DW）was ultrasonically extracted twice with 5-mL Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution（pH 4" 0）and 20-mL acetonitrile/acetic acid（9/1，V/V），purified and concentrated by HLB solid-phase cartridge and then eluted with 5％ammoniated methanol" The residue was dissolved in the combined solution（triethylamine∶phosphoric acid∶water＝0" 66∶0" 74∶100，V/V/V）and acetonitrile at 88∶12 volumetric ratio after evaporated to dryness under a stream of nitrogen gas" With 0" 1％formic acid-containing water and methanol as mobile phases and via gradient elution，the analyte was determined by LC-MS/MS" The result showed that the recovery rates of 4 fluoroquinolones in different spiked manure samples were 66" 19％—115" 00％with a relative standard deviation of 2" 40％—9" 45％，and the detection limit and quantitation limit were 0" 010 mg/kg and 0" 050 mg/kg respectively，indicating that this method could meet the requirement for determining actual manure samples"

Key words：Organic fertilizer；Fluoroquinolones；Detection method；Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Extractant

*通信作者：姚春霞（1976—），女，博士，副研究員，研究方向：土壤和農產品安全。E-mail：chunxia" yao＠163" com

作者簡介：饒欽雄（1979—），男，碩士，助理研究員，研究方向：農產品安全。E-mail：qinxiongrao＠163" com

基金項目：國家質檢公益性行業科研專項（201310269）；上海市自然科學基金（12ZR1420200）；上海市科委重點支撐項目（14DZ1206303）

收稿日期：2015-06-03

文章編號：1000-3924（2016）01-056-05

中圖分類號：X713

文獻標識碼：A