豬圓環病毒2型Rep基因真核表達載體的構建和免疫原性分析

王 靜，劉成倩，李 紅，易建中*，于宗幸，陳 磊，孫曉云

（1上海海洋大學水產與生命學院，上海201306；2上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106）

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豬圓環病毒2型Rep基因真核表達載體的構建和免疫原性分析

王 靜1，2，劉成倩2，李 紅2，易建中2*，于宗幸1，2，陳 磊1，2，孫曉云1，2

（1上海海洋大學水產與生命學院，上海201306；2上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106）

摘 要：根據GenBank發表的豬圓環病毒2型（PCV2）基因序列設計并合成1對特異性引物，進行PCR擴增，從PCV2突變株中擴增出PCV2 Rep基因，對PCR擴增產物清潔后進行雙酶切，連接到pEGFP-C1載體上，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，經PCR篩選和測序后鑒定出正確的重組基因，完成真核表達載體的構建。將重組質粒轉染到PK15細胞中，收取病毒液抽提DNA，PCR檢測到Rep基因，證明轉染是成功的。進行間接免疫熒光試驗，可以檢測Rep基因在PK15細胞中的表達，試驗結果很好的驗證了Rep基因的免疫原性。這為進一步研究PCV2的生物學活性及PCV2新型疫苗奠定了堅實的基礎。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；Rep基因；真核表達載體；間接免疫熒光

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）是已知的最小的動物病毒之一，為單股環狀DNA病毒［1］。根據其抗原性和基因組組成的不同，可分成2種類型，即PCV1和PCV2［2-3］。PCV1沒有致病性，研究的不多；PCV2有致病性，可經口腔、呼吸道等多種途徑感染不同年齡的豬［4］，引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）。此病目前呈世界性分布［5］，給養豬業帶來了巨大的損失。并且PCV2能夠破壞豬體免疫系統，形成免疫抑制，誘發多種病原混合感染或繼發感染，導致難以控制的嚴重疾病［6］。

PCV2病毒有11個開放閱讀框，即OPF1—ORF11，其中，ORF1和ORF2是主要的2個閱讀框。ORF1是最大的開放閱讀框，位于核苷酸的正鏈上，編碼病毒的復制酶蛋白（Rep），參與病毒的復制［7］。PCV2 Rep基因的大小為945 bp，編碼314個氨基酸，具有嚴格的保守性［8］。

本研究通過PCR方法擴增出Rep基因，并克隆到真核表達載體pEGFP-C1上，轉染到PK15細胞中，研究Rep基因在PK15細胞上的表達特性，建立豬圓環病毒間接免疫熒光技術。此技術具有良好的敏感性和特異性，可為PCV2疫苗提供必要的抗體檢測方法，進一步為PCV2疫苗的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

感受態細胞DH5α、PCV2全基因組突變質粒、真核表達載體pEGFP-C1均為上海市農業科學院畜牧獸醫研究所禽病防控研究室保存。內切酶AgeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購自Thermo Scientific公司。高保真PCR擴增KOD酶購自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物公司。轉染試劑Lipofectamine?2000 Reagent購自Lifetech公司。

1．2 引物設計與合成

根據GenBank發表的PCV2基因序列（登陸號：DQ180392" 1）設計并合成Rep基因的特異性引物，在引物的上、下游分別加入AgeⅠ、XhoⅠ這兩個酶切位點。引物序列為：

PCV-Rep-F（AgeⅠ）：5’-GTATGACCGGTCGCCACCATGCCCAGCAAGAAGAGTGG-3’；

PCV-Rep-R（XhoⅠ）：5’-TTCGACTCGAGTCAGTAATTTATTTCATATGGAAAT-3’。

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1．3 PCV2 Rep基因的PCR擴增

以PCV2全基因組突變質粒為模板進行PCV2 Rep基因的PCR擴增。擴增體系為質粒稀釋10倍作為模板取2 μL，10×Buffer（Mg2＋free）5 μL，dNTP（2 mmol/L）5 μL，MgSO44 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1" 5 μL，KOD酶2 μL，ddH2O 29 μL，操作時在冰上進行。PCR的反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，68℃延伸90 s，35個循環；68℃再延伸10 min。PCR結束后取5 μL在1％瓊脂糖凝膠電泳，用紫外分析儀觀察條帶大小，判斷是否為目的條帶。

1．4 PCV2 Rep基因的真核表達載體的構建和鑒定

用限制性內切酶AgeⅠ和XhoⅠ分別對PCV2 Rep基因的PCR清潔產物和表達載體pEGFP-C1雙酶切，取3 μL瓊脂糖電泳，觀察目的條帶正確后，將純化回收的PCR清潔產物與載體pEGFP-C1連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。通過PCR篩選出含有目的片段的重組菌，送到鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。取測序正確的抽提質粒，命名為C1-Rep，雙酶切確定重組質粒的正確性。

1．5 重組質粒轉染PK15細胞

將在96孔、24孔細胞培養板上制備的長成單層的PK15細胞各以PBS沖洗2次，按照轉染說明書，將經過轉染試劑處理的重組質粒分別加入細胞培養板孔，編號。37℃、5％CO2培養箱中培養約6 h，換加2％血清的DMEM細胞液，再培養72 h。同時設立不轉染的正常PK15細胞作陰性對照。PCV病毒液感染作為陽性對照。

1．6 重組質粒轉染PK15細胞的檢測

在培養箱培養72 h后，將24孔板直接放入－80℃冰箱，反復凍融3次后，2 000 g離心10 min，取上清，用酚氯仿法抽提DNA。

以抽提的DNA為模板進行PCR檢測，引物采用PCV2-Rep-F/R，模板取4 μL，10×Buffer（Mg2＋）2" 5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶0" 3 μL，加ddH2O補至25 μL。反應結束后，取PCR產物5 μL在1％瓊脂糖膠上電泳。

1．7 免疫熒光試驗

將96孔板中的細胞培養液倒去，于各孔中加入100 μL－20℃預冷的75％乙醇，4℃放置0" 5 h固定。隨后，棄去乙醇，PBS洗滌2次，務必使有機溶劑揮發干凈。之后，用5％脫脂奶粉在37℃恒溫培養箱中封閉50 min。結束后，每孔加入100 μL用5％脫脂奶稀釋的PCV一抗，稀釋比例為1∶1 500，37℃作用1" 5 h。PBS洗3次后每孔加入一定稀釋度的FITC標記山羊抗豬IgG，37℃避光作用1 h。PBS洗3次后甩干，鏡檢。

2 結果與分析

2．1 PCV2 Rep基因的PCR擴增

以PCV2全基因組質粒為模板，以PCV2-Rep-F、PCV2-Rep-R為引物進行PCR擴增，擴增得到的片段全長約為945 bp（圖1），與預期片段相符。

圖1　PCV2-Rep基因的PCR擴增Fig．1 PCR amplification of PCV2-Rep gene

2．2 C1-Rep基因的真核表達載體的構建和鑒定

將pEGFP-C1質粒與PCV2 Rep基因的PCR擴增產物分別用Age I和Xho I雙酶切連接后，挑取轉化后的菌落進行PCR篩選，在1％瓊脂糖凝膠中點樣電泳，能檢測到約945 bp的基因片段即陽性菌（圖2）。

經測序正確后的陽性菌接菌后提取質粒，分別用Age I和Xho I進行雙酶切鑒定，得到約4 731 bp和945 bp 2個片段，分別與載體和Rep基因的長度一致（圖3）。

圖2　重組質粒陽性菌的篩選電泳圖Fig．2 Screening electropherogram of recombinant plasmid’s Gram-positive bacteria

圖3　重組質粒的酶切鑒定電泳圖Fig．3 Enzyme digestion electropherogram of recombinant plasmid

2．3 重組質粒轉染PK15細胞的檢測

重組質粒轉染PK15細胞后，經過72 h的培養反復凍融后收取上清液，提取上清液中的DNA，用PCR方法檢測。通過在1％瓊脂糖凝膠中點樣電泳，在C1-Rep重組質粒和陽性對照中均觀察到約945 bp的基因片段，陰性對照則無。說明重組質粒轉染PK15細胞后收取的上清液中含有Rep基因，重組質粒成功轉染PK15細胞，符合預期結果（圖4）。

圖4　病毒液DNA PCR檢測電泳圖Fig．4 PCR electropherogram of virus liquid’s DNA

2．4 重組質粒的免疫熒光試驗試驗

重組質粒轉染PK15細胞后，經過72 h的培養進行免疫熒光試驗，通過熒光顯微鏡觀察，根據熒光的強弱判斷免疫熒光的結果，陽性細胞孔內可觀察到典型的特異性亮綠色熒光，而陰性對照的細胞孔內無特異性綠色熒光。設定PCV病毒液感染的PK15細胞孔為陽性對照，單純PK15細胞孔為陰性對照。由觀察可見，在C1-Rep重組質粒和陽性對照中發現綠色熒光，陰性對照沒有（圖5）。

1：陽性對照；2：C1-Rep重組質粒；3：陰性對照圖5　重組質粒的免疫熒光試驗（100×）Fig．5 Immunofluorescence assay of recombinant plasmid（100×）

3 討論

一般認為，PCV2-OPF2編碼病毒的主要結構蛋白，即Cap蛋白，是PCV2的主要免疫保護性抗原，對PCV2疫苗的研究有重要的意義，研究較多，本實驗室亦成功構建了Cap基因的原核表達載體并表達［9］，驗證了Cap蛋白的反應原性。而對Rep蛋白的生物學特性報道不多。Rep蛋白作為PCV2病毒的復制酶蛋白，主要參與病毒的復制。而PCV2只有在動物體內增殖時才可刺激機體產生抗Rep蛋白抗體［10］，在PK15細胞中Rep蛋白可以同時存在于細胞漿和細胞核中，隨著表達量的高低分布稍有變化，但不表現出對某一方面的親嗜性［11］。有報道說明Rep基因上含有一個優勢免疫反應區［12］，有一定的免疫原性。

間接免疫熒光試驗作為實驗室檢測PCV2的方法之一，宜用于檢測細胞培養物中的PCV2［13］。本研究通過間接免疫熒光試驗檢測PCV2 Rep蛋白在PK15細胞中的表達情況，說明構建的真核PCV2 Rep基因在PK15上可以表達，初步確定了Rep蛋白的免疫原性，為接下來的研究提供了檢測依據和實驗基礎。因為沒有一個定量指標，本實驗無法準確的測定蛋白表達的多少，有待于下一步研究。

參 考 文 獻

［1］Tischer I，Gelderblom H，Vettermann W" A very small porcine virus with a circular single stranded DNA［J］" Nature，1982，295：64-66"

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［3］Mankertz A，Hillenbrand B" Analysis of transcription of porcine circovirus type 1［J］" J Gen Viral，2002，83（11）：2743-2751"

［4］Stevenson G W，Kiupel M，Mittal S K" Ultera-structure of papovavirus-and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines［J］" Vet Path，1999，36：36-378"

［5］楊漢春"豬免疫抑制性疾病的流行特點與控制對策［J］"中國畜牧獸醫，2004，31（5）：41-43"

［6］Chae C" A review of porcine circoviruses 2-associated syndromes and diseases［J］" Vet J，2005，169（3）：326-336"

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（責任編輯：程智強）

Construction andimmunogenicity analysis of eukaryotic expression vector of porcine circovirus type 2 Rep gene

WANG Jing1，2，LIU Cheng-qian2，LI Hong2，YI Jian-zhong2*，YU Zong-xing1，2，CHEN Lei1，2，SUN Xiao-yun1，2
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：A pair of specific primers was designed and synthesized according to the porcine circovirus type 2（PCV2）gene sequence published in the GenBank，the PCV2 Rep gene was amplified by PCR from mutant strains of PCV2，and after cleaning and double digests the amplified products were connected to the pEGFP-C1 vector and transformed into E．coli DH5α competent cells" The correct recombinant gene was identified by PCR screening and sequencing，indicating the construction of eukaryotic expression vector was finished" The recombinant plasmid was transfected into PK15 cells，and then the virus liquid was collected to extract the DNA" The Rep gene detected by PCR proved that the transfection was successful" The experimental results well verified the immunogenicity of Rep gene in PK15 cells，thus laying a solid foundation for further study of the biological activities and new vaccine of PCV2"

Key words：Porcine circovirus type 2；Rep gene；Eukaryotic expression vector；Indirect immunofluorescence

*通信作者，E-mail：yijianzhong＠yahoo" com

作者簡介：王靜（1989—），女，碩士，主要從事動物疾病的分子生物學及免疫學研究。E-mail：jing1248＠126" om

基金項目：上海市科學技術委員會重點科技攻關項目（12391901900）

收稿日期：2015-02-03

文章編號：1000-3924（2016）01-006-04

中圖分類號：S852" 65

文獻標識碼：A