鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(dá)變化及其與MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)性的關(guān)系

魯明騫，孔慶志，許新華，盧宏達(dá)，趙華山，周剛，徐冰清，郭蓉

(1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心，湖北宜昌443003；2武漢市中心醫(yī)院)

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鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(dá)變化及其與MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)性的關(guān)系

魯明騫1，孔慶志2，許新華1，盧宏達(dá)2，趙華山1，周剛1，徐冰清1，郭蓉1

(1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心，湖北宜昌443003；2武漢市中心醫(yī)院)

目的觀察鼻咽癌組織中絲裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)蛋白的表達(dá)變化，并探討其與MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)性的關(guān)系。方法 鼻咽癌患者90例，術(shù)中留取腫瘤組織和癌旁組織。采用免疫組化檢測(cè)鼻咽癌組織和癌旁組織中的MKK4蛋白；采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)患者M(jìn)KK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果 鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(dá)陽(yáng)性68例(75.6%)、MKK4蛋白低表達(dá)26例(40%)、高表達(dá)54例(60%)，癌旁組織中MKK4蛋白表達(dá)陽(yáng)性85例(94.4%)，MKK4蛋白低表達(dá)18例(20.0%)，高表達(dá)72例(80.0%)。MKK4蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.05)。鼻咽癌患者M(jìn)KK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G為TT基因型16例(17.8%)，TG基因型51例(56.7%)，GG基因型23例(25.6%)，TG+GG基因型74例(82.2%)。MKK4蛋白低表達(dá)的36例中，MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 TT基因型10例(27.8%)、TG基因型19例(52.8%)、GG基因型7例(19.4%)、TG+GG基因型26例(72.2%)；MKK4蛋白高表達(dá)的54例中MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 TT基因型6例(11.1%)、TG基因型32例(59.3%)、GG基因型16例(29.6%)、TG+GG基因型48例(88.9%)。MKK4蛋白低表達(dá)者與高表達(dá)者M(jìn)KK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T→G發(fā)生率相比，P<0.05。結(jié)論 鼻咽癌組織中MKK4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，MKK4蛋白低表達(dá)可能與鼻咽癌發(fā)病有關(guān)；MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T→G突變者M(jìn)KK4蛋白表達(dá)增高。

鼻咽癌；絲裂原活化蛋白激酶激酶4；基因啟動(dòng)子區(qū)；基因多態(tài)性

鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病率居頭頸部惡性腫瘤的首位[1]。鼻咽癌的發(fā)生與遺傳、EB病毒感染、環(huán)境等因素有關(guān)，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，絲裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)作為MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的構(gòu)成部分，可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程及血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程[2～4]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、缺失和插入，導(dǎo)致在某一人群基因組內(nèi)特定核苷酸位置上出現(xiàn)不同的堿基[5]。SNP與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6]。SNP研究最為廣泛的區(qū)域是啟動(dòng)子區(qū)域。目前研究表明MKK4啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)與多種惡性腫瘤關(guān)系密切，包括鼻咽癌。本研究觀察了鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(dá)水平，并探討其與MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)性的關(guān)系，為鼻咽癌的診斷和治療提供相關(guān)理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料2002年1月～2009年12月入院治療的鼻咽癌患者90例，其中男54例、女36例，年齡22～73(45.3±5.2)歲。全部患者均為初診鼻咽癌，病灶位于咽隱窩70例、頂后壁20例。低分化鱗癌85例、未分化癌5例。Ⅰ、Ⅱ期53例、Ⅲ、Ⅳ期37例。所有患者行常規(guī)放射治療，中晚期患者輔以DDP+5-FU誘導(dǎo)方案化療。取活檢術(shù)中留取的腫瘤組織和癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本；留取患者外周靜脈血2 mL。

1.2MKK4蛋白檢測(cè)將組織標(biāo)本制備成4 μm厚的連續(xù)切片，經(jīng)組織切片脫蠟、水化、高溫高壓抗原修復(fù)后，滴加MKK4單克隆抗體(1∶80)，4 ℃過(guò)夜后37 ℃復(fù)溫45 min，PBS洗滌3次，滴加生物素化二抗，37 ℃ 20 min，PBS洗滌3次，滴加SABC試劑，37 ℃ 20 min，PBS洗滌4次，加DAB顯色劑后顯微鏡觀察。結(jié)果判定：MKK4蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核，呈棕黃色。根據(jù)Fromowitz綜合評(píng)分法，用陽(yáng)性細(xì)胞百分比與著色強(qiáng)度綜合判定結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分，5%～<25%計(jì)1分，25%～<50%計(jì)2分，50%～<75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分；細(xì)胞著色強(qiáng)度為無(wú)染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；上述兩項(xiàng)得分相乘，0～1判定蛋白表達(dá)陰性、≥2判定為蛋白表達(dá)陽(yáng)性,0～2為低表達(dá)、≥3為高表達(dá)。

1.3MKK4基因-1304 T/G多態(tài)性觀察 將患者血液離心后，提取凍血DNA，采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)測(cè)定MKK4-1304 T>G(rs3826392)的基因型，上游引物序列為5′-GAAGATATTGGGCAGCCAAC-3′，下游引物序列為5′-CAGCCTTGCCTAAAATGGAA-3′。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))適溫延伸，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min。用核酸內(nèi)切酶Sml Ⅰ消化擴(kuò)增好的片段，然后置于2%瓊脂糖凝膠分離。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型及等位基因頻率。如果數(shù)據(jù)方差不齊，采用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(dá)陽(yáng)性68例(75.6%)，MKK4蛋白低表達(dá)26例(40%)，高表達(dá)54例(60%)。癌旁組織中MKK4蛋白表達(dá)陽(yáng)性85例(94.4%)，MKK4蛋白低表達(dá)18例(20.0%)，高表達(dá)72例(80.0%)。MKK4蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05)。鼻咽癌患者M(jìn)KK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G為TT基因型16例(17.8%)，TG基因型51例(56.7%)，GG基因型23例(25.6%)，TG+GG基因型74例(82.2%)。

MKK4蛋白低表達(dá)的36例中，MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 TT基因型10例(27.8%)、TG基因型19例(52.8%)、GG基因型7例(19.4%)、TG+GG基因型26例(72.2%)；MKK4蛋白高表達(dá)的54例中MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 TT基因型6例(11.1%)、TG基因型32例(59.3%)、GG基因型16例(29.6%)、TG+GG基因型48例(88.9%)。MKK4蛋白低表達(dá)者與高表達(dá)者M(jìn)KK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T→G發(fā)生率相比，P均<0.05。

3　討論

鼻咽癌是最常見的頭部惡性腫瘤，近年來(lái)分子靶向藥物的研發(fā)和應(yīng)用為鼻咽癌的治療帶來(lái)了新的曙光。MKK4作為MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，是癌基因Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用[7]，能同時(shí)磷酸化并激活JNK通路和p38通路，將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，引起相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)。

既往研究[8～11]表明MKK4蛋白在多種惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，其表達(dá)程度越高，腫瘤惡性程度越高，預(yù)后越差[12]，也有學(xué)者[13，14]得出過(guò)不同的結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，MKK4蛋白在鼻咽癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織。我們前期結(jié)果研究表明腫瘤分期越晚，MKK4表達(dá)越高，與鼻咽癌惡性程度呈負(fù)相關(guān)[15]。細(xì)胞受到外界環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的刺激，可激活JNK和(或)p38通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境變化，進(jìn)一步引起MKK4蛋白表達(dá)異常。由此推測(cè)MKK4蛋白表達(dá)下調(diào)可能是鼻咽癌發(fā)生的啟動(dòng)因素之一。

SNP是指由于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、缺失和插入，導(dǎo)致在不同個(gè)體間DNA序列中單個(gè)堿基的差異[16]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)性與多種惡性腫瘤易感性相關(guān)，MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 G突變能夠降低各種惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)。Wei等[19]發(fā)現(xiàn)MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T→G突變與大腸癌的發(fā)病有一定相關(guān)性，G突變能減少大腸癌的發(fā)生，但馮飛躍等[20]在食管癌中的研究認(rèn)為MKK4啟動(dòng)子區(qū)-1304 T>G突變與食管癌無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T/G多態(tài)性與鼻咽癌關(guān)系密切[18]，MKK4蛋白低表達(dá)者與高表達(dá)者M(jìn)KK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T→G突變發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MKK4蛋白高表達(dá)患者攜帶-1304 GG和-1304 GT的發(fā)生率高于低表達(dá)患者，可能是通過(guò)上調(diào)MKK4蛋白表達(dá)而增強(qiáng)MKK4基因啟動(dòng)子的活性，同時(shí)隨著MKK4蛋白表達(dá)的增高，-1304 TG和-1304 GG檢出率逐漸增高，-1304 T→G突變能上調(diào)MKK4蛋白表達(dá)。國(guó)內(nèi)劉斌等[21]發(fā)現(xiàn)EB病毒陽(yáng)性的MKK4基因患者攜帶TG基因型者患鼻咽癌的危險(xiǎn)性下降了22%，而GG基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降了36%，且隨著保護(hù)性等位基因(G)個(gè)數(shù)的增加，鼻咽癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)呈逐漸下降趨勢(shì)，與本研究結(jié)果基本一致。

總之，鼻咽癌組織中MKK4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，MKK4蛋白低表達(dá)可能與鼻咽癌發(fā)病有關(guān)；MKK4基因啟動(dòng)子區(qū)-1304 T→G突變能上調(diào)MKK4蛋白表達(dá)。隨著MKK4與鼻咽癌關(guān)系研究的不斷深入，其分子機(jī)制將被逐步了解，這將為鼻咽癌的診斷和治療提供更多幫助。

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湖北省自然基金面上項(xiàng)目(2014CFB675)；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(D20141205)；湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金項(xiàng)目(WJ2015MB176)；宜昌市科技研究與開發(fā)項(xiàng)目(A12301-03)。

孔慶志(E-mail： whzlkqz@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.020

R739.6

B

1002-266X(2016)31-0063-03

2016-02-18)