NRF2通路在慢性腎臟疾病發生發展中的作用研究進展

吉琳梅，沈宏春，樊均明

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2西南醫科大學附屬中醫院；3西南醫科大學)

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NRF2通路在慢性腎臟疾病發生發展中的作用研究進展

吉琳梅1，沈宏春2，樊均明3

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2西南醫科大學附屬中醫院；3西南醫科大學)

越來越多的證據表明慢性腎臟疾病(CKD)與氧化應激有關。CKD患者腎臟組織中活性氧產生酶激活或上調、線粒體功能異常或內質網應激等導致氧化穩態失衡，促使CKD病情進展。轉錄因子NF-E2相關因子2(NRF2)在受到活性氧或親電試劑等刺激后，通過與KEAP1解離進入細胞核內，與ARE序列結合(KEAP1-NRF2-ARE通路)，發揮其調節氧化應激的作用。激活NRF2通路或上調NRF2表達、降低氧化應激水平可延緩如狼瘡腎炎、糖尿病腎病、5/6腎切除后等多種CKD病情進展。然而，激活NRF2通路并非都對CKD患者有益。NRF2通路對糖尿病腎病存在雙向調節作用，作用取決于NRF2的激活程度。

轉錄因子NF-E2相關因子2；慢性腎臟疾病；氧化應激

慢性腎臟疾病(CKD)發病率高，受到學者廣泛關注。在CKD早期階段，通過控制血糖、血壓及應用胰島素等方法可延緩進展；而到腎衰竭終末階段，各種機體紊亂可導致嚴重甚至威脅生命的并發癥，必須通過各種腎臟替代治療以維持生命。因此，延緩甚至逆轉CKD患者的腎功能對于延長患者生命有重要意義。近年來多項研究表明轉錄因子NF-E2相關因子2(NRF2)信號通路在腎損傷過程中扮演著保護性角色，在CKD動物模型中抑制NRF2通路后，其下游目標基因表達也受到抑制，進而一系列對腎臟的抗氧化保護作用便會隨之喪失。現就NRF2通路與CKD相關研究進展做一綜述。

1　氧化應激在慢性腎臟病發病中的作用

氧化應激是氧化物產生過多、同時抗氧化物大量減少后產生的，在生物學系統中活性氧簇(ROS)是氧化應激最重要的貢獻者。腎臟的ROS主要源于活性氧產生酶(如NADPH氧化酶)激活或上調、線粒體功能異常或內質網應激等[1]，CKD患者中氧化應激普遍存在[2]。Yuan等[3]研究表明，在近端腎小管上皮細胞中，線粒體功能缺陷與上皮間充質轉分化的病理過程有很大關聯，而這與腎臟纖維化密切相關。Nishida等[4]用單側輸尿管梗阻模型證實各種線粒體蛋白在腎纖維化早期就有所下降。接受血液透析的CKD患者也存在線粒體呼吸系統受損及高水平氧化應激情況[5]。其他細胞源性的ROS來源于NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶及脂肪氧化酶等。血清尿酸水平升高是CKD氧化應激的重要因素，而尿酸產生于黃嘌呤氧化酶。Omori等[6]制作了單側輸尿管梗阻的大鼠模型，發現阻斷黃嘌呤氧化酶后腎臟損傷減輕。除此之外，ROS還來源于腎素-血管緊張素系統(RAS)的激活[7]。

ROS水平被一系列抗氧化酶所控制，具體包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、血紅素氧化酶1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)及谷胱甘肽(GSH)等硫醇分子。Hinerfeld等[8]研究表明線粒體SOD基因缺陷小鼠產生了嚴重的氧化應激及糖尿病并發癥。此外，有學者[9]還發現對小鼠進行轉基因干預使CAT過表達后模型小鼠的腎功能有所改善。

各期CKD患者體內的細胞代謝都可產生大量的氧自由基，過度產生的ROS具有極高的活性，能夠氧化蛋白質、脂類及核酸等，而這些氧化產物(如丙二醛)可進一步導致細胞及組織損傷，加速CKD進程。因此，體內氧化應激水平與CKD的病程進展密切相關，激活或過表達抗氧化酶后表現出明顯的腎臟保護作用。

2　NRF2通路在氧化應激中的調節作用

NRF2是一種帶有堿性亮氨酸拉鏈模體(bZIP)的轉錄因子，對體內的氧化還原狀態十分敏感。NRF2控制著1%左右的人類基因表達，這些基因擁有共同的順式作用元件，即抗氧化反應元件(ARE)，NRF2通過ARE調節活性氧解毒酶表達，這被認為是抵御ROS損傷的主要機制[10]。正常情況下，胞質蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(KEAP1)將NRF2鎖在胞質中，并通過與E3連接酶相連促進NRF2降解；當KEAP1的半胱氨酸殘基受ROS或親電體修飾時，KEAP1發生構象變化，導致這種“鎖定”作用消失，NRF2進入胞核，激活下游抗氧化目標基因轉錄[11]，增強細胞抗氧化作用。

NRF2在維持氧化還原穩態中扮演著重要角色。經親電體處理細胞后，各種化學物質通過對抗KEAP1的作用激活NRF2，但NRF2的作用也受到生長因子的調節，如糖原合成酶3(GSK-3)等。Salazar等[12]首次報道GSK-3可抑制NRF2目的基因表達并使轉錄因子磷酸化。NRF2 的保守序列被分為6個功能域，即Neh1-Neh6，而其中Neh6上有兩個與β-TrCP 相互作用的模序。Rada等[13]發現GSK-3可使DSGIS模體中的絲氨酸殘基磷酸化，然后與SCFβ-TrCP泛素連接酶的β-TrCP亞基結合，經泛素化修飾后降解。最近，Hayes等[14]用叔丁基對苯二酚和萊菔硫烷處理Keap1+/+小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)，發現正常情況下NRF2的目的基因醌氧化還原酶(NQO1)和血紅素加氧酶1(Hmox1)均過表達，而Keap1+/+的MEF并沒有如此表現；叔丁基對苯二酚在誘導Keap1 +/+的MEF表達NQO1和Hmox1時，伴隨有GSK-3β絲氨酸磷酸化抑制及PKB/Akt絲氨酸磷酸化激活，表明PI3K對NRF2也有確定的調節作用。

3　NRF2通路在CKD發病、進展中的作用

多項證據表明NRF2通路與CKD關系密切。狼瘡腎炎中，氧化應激及炎癥發揮著關鍵作用。免疫復合物沉積在腎小球導致氧化應激，進一步損傷腎小球[15]。早期研究[16]顯示，敲除了RNF2基因的雌性小鼠發生了狼瘡樣自身免疫性腎炎。Jiang等[17]發現，自發型狼瘡腎炎模型中有RNF2基因缺陷的動物腎損傷更嚴重。Ka等[18]認為檸檬醛可通過上調NRF2表達，減輕狼瘡腎炎小鼠的腎損害。

NRF2通路對糖尿病腎病的進展也有調節作用。高血糖引起微血管損害主要包括四個途徑：增加糖化終產物形成，激活蛋白激酶C及通過多元醇和己糖胺加速葡萄糖流量，氧化應激是這些通路的共同連接點[19]。在用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病動物模型中，去除RNF2基因組表現出更嚴重的炎癥、氧化應激及腎病[20]。Cui等[21]證實給予糖尿病小鼠NRF2激動劑(即SFN或肉桂醛)后能明顯減輕小鼠蛋白尿及腎臟氧化應激水平。

在5/6腎切除的CKD動物模型中，Kim等[22]首次證明了NRF2通路的重要性：在這種模型中，殘余腎表現出谷胱甘肽缺乏、脂質過氧化、NF-κB表達上調及NADPH氧化酶激活，且術后12周殘余腎中NRF2活性明顯降低，同時CAT、SOD等抗氧化物質有所下降。在自發性局灶性節段性腎小球硬化Imai大鼠模型中，腎臟細胞中NFR2水平及其目標靶基因表達均明顯降低，表現出嚴重的氧化應激反應及炎癥反應[23]。Aminzadeh等[24]發現，在腺嘌呤誘導的小管間質性腎病模型中，NRF2活性受到抑制，且CAT、HO-1、GCL表達也受到抑制。

上述動物實驗證實了NRF2對CKD動物腎臟的保護作用，同樣也有多種證據表明了NRF2通路在人類CKD病理發展過程中的作用。最近，Martini等[25]在前人研究基礎上，整合了腎小球濾過率調節相關基因位點的相關調節通路，繪制出CKD分子圖譜，發現這些通路聚集成一個主要由炎癥和代謝相關通路組成的網絡，而NRF2介導的氧化應激反應在其中發揮至關重要的作用。Crawford等[26]研究表明CKD患者血GPx、CAT活性降低，并且GPx的單核苷酸多態性在CKD患者中發生率較高，表明GPx與CKD發病有關。

隨著對NRF2研究的深入，學者們發現，激活NRF2通路并非都對CKD患者有益。Pergola等[27]的研究納入了伴有不同程度CKD的2型糖尿病患者，經NRF2激動劑甲基巴多索隆治療后24～52周患者eGFR增高；然而第三期臨床研究卻發現，與安慰劑組相比，經甲基巴多索隆治療后eGFR、血壓及尿白蛋白/肌酐比值(ACR)均顯著增高，且心血管事件危險性大大增加[28]。這表明糖尿病患者并非總能從NRF2過表達中獲益，高血糖誘導活性氧產生及NRF2通路慢性激活，同時可能誘導腎內RAS系統激活，從而導致系統性高血壓、蛋白尿及腎小管細胞凋亡與萎縮，進一步加劇糖尿病腎病進展。以上研究表明，NRF2通路對糖尿病腎病存在雙向調節作用，作用取決于NRF2的激活程度。

基于上述研究結論，我們認為，NRF2在CKD(尤其是糖尿病腎病)發病及進展過程中的作用及調節機制還需進一步深入研究，以期找到真正有效的延緩CKD進展的治療靶點。

[1] Holmstrom KM,Baird L,Zhang Y,et al.Nrf2 impacts cellular bioenergetics by controlling substrate availability for mitochondrial respiration[J].Biol Open,2013,2(8):761-770.

[2] Pieczenik SR,Neustadt J.Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease[J].Exp Mol Pathol,2007,83(1):84-92.

[3] Yuan Y,Chen Y,Zhang P,et al.Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells[J].Free Radic Biol Med,2012,53(1): 30-43.

[4] Nishida H,Kurahashi T,Saito Y,et al.Kidney fibrosis is independent of the amount of ascorbic acid in mice with unilateral ureteral obstruction[J].Free Radic Res,2014,48(9):1115-1124.

[5] Ruskovska T,Jansen EH,Antarorov R.Evaluation of assays for measurement of serum (anti)oxidants in hemodialysis patients[J].Biomed Res Int,2014,2014(8):843157-843157.

[6] Omori H,Kawada N,Inoue K,et al.Use of xanthine oxidase inhibitor febuxostat inhibits renal interstitial inflammation and fibrosis in unilateral ureteral obstructive nephropathy[J].Clin Exp Nephrol,2012,16(16):549-556.

[7] Kim HJ,Sato T,Rodríguez-Iturbe B,et al.Role of intrarenal angiotensin system activation,oxidative stress,inflammation,and impaired nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 activity in the progression of focal glomerulosclerosis[J].J Pharmacol Exp Ther,2011,337(3):583-590.

[8] Hinerfeld D,Traini MD,Weinberger RP,et al.Endogenous mitochondrial oxidative stress: neurodegeneration,proteomic analysis,specific respiratory chain defects,and efficacious antioxidant therapy in superoxide dismutase 2 null mice[J].J Neurochem,2004,88(3):657-667.

[9] Brezniceanu ML,Liu F,Wei CC,et al.Catalase overexpression attenuates angiotensinogen expression and apoptosis in diabetic mice[J].Kidney Int,2007,71(9):912-923.

[10] Cheng Y,Ren X,Gowda AS,et al.Interaction of Sirt3 with OGG1 contributes to repair of mitochondrial DNA and protects from apoptotic cell death under oxidative stress[J].Cell Death Dis,2013,4(4):e731.

[11] Tong KI,Padmanabhan B,Kobayashi A,et al.Different electrostatic potentials define ETGE and DLG motifs as hinge and latch in oxidative stress response[J].Mol Cell Biol,2007,27(21):7511-7521.

[12] Salazar M,Rojo AI,Velasco D,et al.Glycogen synthase kinase-3beta inhibits the xenobiotic and antioxidant cell response by direct phosphorylation and nuclear exclusion of the transcription factor Nrf2[J].J Biol Chem,2006,281(21):14841-14851.

[13] Rada P,Rojo AI,Evrard-Todeschi N,et al.Structural and functional characterization of Nrf2 degradation by the glycogen synthase kinase 3/β-TrCP axis[J].Mol Cell Biol,2012,32(17):3486-3499.

[14] Hayes JD,Chowdhry S,Dinkova-Kostova AT,et al.Dual regulation of transcription factor Nrf2 by Keap1 and by the combined actions of β-TrCP and GSK-3[J].Biochem Soc Trans,2015,43(4):611-620.

[15] Kovacic P,Jacintho JD.Systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases from endogenous and exogenous agents: unifying theme of oxidative stress[J].Mini Rev Med Chem,2003,3(6):568-575.

[16] Yoh K,Itoh K,Enomoto A,et al.Nrf2-deficient female mice develop lupus-like autoimmune nephritis[J].Kidney Int,2001,60(4):1343-1353.

[17] Jiang T,Tian F,Zheng H,et al.Nrf2 suppresses lupus nephritis through inhibition of oxidative injury and the NF-κB-mediated inflammatory response[J].Kidney Int,2014,85(2):333-343.

[18] Ka SM,Lin JC,Lin TJ,et al.Citral alleviates an accelerated and severe lupus nephritis model by inhibiting the activation signal of NLRP3 inflammasome and enhancing Nrf2 activation[J].Arthritis Res Ther,2015,17(1):1-13.

[19] Madonna R,De Caterina R.Cellular and molecular mechanisms of vascular injury in diabetes - Part II: Cellular mechanisms and therapeutic targets[J].Vascul Pharmacol,2011,54(3-6):75-79.

[20] Zheng H,Whitman SA,Wu W,et al.Therapeutic potential of Nrf2 activators in streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J].Diabetes,2011,60(11): 3055-3066.

[21] Cui W,Bai Y,Miao X,et al.Prevention of diabetic nephropathy by sulforaphane: possible role of Nrf2 upregulation and activation[J].Oxid Med Cell Longev,2012,2012(8 suppl3):1299-1309.

[22] Kim HJ,Vaziri ND.Contribution of impaired Nrf2-Keap1 pathway to oxidative stress and inflammation in chronic renal failure[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(3):F662-671.

[23] Kim HJ,Sato T,Rodríguez-Iturbe B,et al.Role of intrarenal angiotensin system activation,oxidative stress,inflammation,and impaired nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 activity in the progression of focal glomerulosclerosis[J].J Pharmacol Exp Ther,2011,337(3):583-590.

[24] Aminzadeh MA,Nicholas SB,Norris KC,et al.Role of impaired Nrf2 activation in the pathogenesis of oxidative stress and inflammation in chronic tubulo-interstitial nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(8):2038-2045.

[25] Martini S,Nair V,Keller BJ,et al.Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD[J].J Am Soc Nephrol,2014,25(11):2559-2572.

[26] Crawford A,Fassett RG,Coombes JS,et al.Relationship between antioxidant enzyme genotype and activity and kidney function: a case-control study[J].Clin Nephrol,2012,78(2):135-144.

[27] Pergola PE,Raskin P,Toto RD,et al.Bardoxolone methyl and kidney function in CKD with type 2 diabetes[J].N Engl J Med,2011,365(4):327-336.

[28] de Zeeuw D,Akizawa T,Audhya P,et al.Bardoxolone methyl in type 2 diabetes and stage 4 chronic kidney disease[J].N Engl J Med,2013,369(26):2492-2503.

中國博士后科學基金第55批面上項目“西部地區博士后人才資助計劃”(2014M552544XB)；四川省科技廳基金資助項目( 2011JTD0014)；四川大學·瀘州市人民政府戰略合作科技項目(2013CDLZ-S20)。

樊均明(E-mail: junmingfan@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.037

R692.5

A

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2015-12-15)