藥食兩用植物對幽門螺桿菌的抑菌活性測定

太原師范學院（030012）喬宏萍 武曉英 燕平梅 郝雪峰 陳燕飛

上海交大昂立股份有限公司生物醫藥研究院（200233）沙大年

幽門螺旋菌（Helicobacter pylori Hp）是一種寄居在人體胃黏膜里呈S形或弧形彎曲的革蘭氏陰性桿菌。Hp具有很強的活性與繁殖能力，是一種嚴重影響公眾健康的細菌。在發展中國家成人感染率可以達到90%，現已報道，Hp與各種慢性胃炎都有關系，可以損害胃黏膜屏障，甚至破壞胃的正常結構及功能；導致胃酸減少或缺乏；減少人體對鐵質及維生素B12的吸收；增加腸道感染的機會；通過人與人的直接或間接接觸，感染其他健康人群[1][2][3]。目前臨床上對Hp感染的治療主要采用以抗生素為主的治療方案，盡管在一定程度上可以治愈Hp感染，卻不能預防其再感染。在沒有經過充分地根除治療，黏膜層中的Hp仍能存活，細菌可再次粘附并移生于胃上皮細胞，繼續感染。Hp對胃黏膜很強的粘附作用，經血液循環的藥物到達黏膜時也很難接近Hp，故徹底消除HP實屬不易。攜帶或感染Hp的人群中，其中大部分人一開始并不表現出不適癥狀，但是這些人無疑是攜帶了一個“定時炸彈”，時時刻刻會危害人們的健康[4-9]。隨著當今預防科學的發展，人們更提倡防病于未然，即以養生保健為主動方法，通過日常飲食達到預防疾病，調節人體生理狀態的目的。因此，本研究選用藥食兩用的植物篩選對幽門螺桿菌具有抑菌效果的組分，為將開發中藥制劑和保健食品提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 藥食兩用植物蒲公英、甘草、菊花、薄荷、烏梅、生山楂購自藥店。

1.1.2 供試菌種 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori ATCC43504）由本實驗室保存。

1.1.3 培養基 固體培養基為改良的Skirrow選擇性培養基（蛋白胨15g、胰蛋白胨2.5g、酵母浸膏5.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g、蒸餾水1000ml），即在1000ml改良的Skirrow瓊脂基礎中加入抗生素混合液，使其濃度為甲氧芐氨嘧啶TMP5mg/L，萬古霉素10mg/L，多粘菌素B2500IU/L，并加入50ml脫纖維凍融兔血。

1.2 試驗方法

1.2.1 Hp菌懸液制備 先將保存的菌株活化，培養條件為改良Skirrow選擇性固體培養基，微需氧37℃孵育72h。平板上長出Hp菌落，直徑約1mm，透明、濕潤、稍隆起圓形，呈針尖樣。菌體革蘭染色陰性，呈彎曲“S”形。將典型菌落傳代，同樣條件下培養72h。用布氏肉湯洗下菌落，收集菌液，再以布氏肉湯校正菌懸液濃度。測量抑菌圈實驗時，菌懸液濃度約為108CFU/ml。

1.2.2 藥液的制備 將植物烘干、剪碎后置于燒杯中，加蒸餾水沒過植物1cm左右，浸泡30min，然后加2倍植物量的水，加熱煮沸，30min后用紗布過濾，再加入同樣量的水沒過濾渣，煮沸30min后過濾，兩次濾液合并濃縮至1g/mL，高壓滅菌20min，4℃備用。

1.2.3 抑菌圈的測定方法 采用打孔瓊脂擴散法。取直徑9cm，培養基厚度約4mm的改良Skirrrow選擇性培養基的平板，每塊平板加入100μlHp菌懸液，立即用涂布棒涂布均勻。之后，每個培養皿打直徑5mm的小孔5個，呈均勻分布。往每孔中加入15μl不同品種的中藥液，微需氧37℃培養72h，觀察抑菌圈，測量直徑。每味中藥重復3次。

1.2.4 最小抑菌濃度（the Minimum Inhibitory Concentrations MIC）的測定：以藥液與改良Skirrow培養基混合的方式將藥液稀釋成不同濃度（0.8g/ml、0.6g/ml...逐次稀釋到0.02g/ml、0.01g/ml），倒入無菌培養皿中。待培養基凝固后，用移液槍取50μL幽門螺桿菌的菌懸液滴于固體培養基表面，涂布器涂布均勻，微需氧37℃培養72 h，觀察菌落生長情況，以一般小于5個菌落的最低濃度為最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 抑菌作用：對蒲公英、甘草、薄荷、烏梅、山楂和菊花六種藥食兩用的植物進行了浸泡、煎熬、離心和濃縮，最后濃縮為1g/ml的藥液，滅菌后，測定了其對Hp的抑制能力，結果除了山楂沒有抑菌效果外，其它的5種植物都出現了不同的抑菌圈，抑菌圈最大的為烏梅3.2cm，其次為菊花2.83cm，薄荷2.81cm，蒲公英2.1cm，抑菌圈最小的為甘草1.2cm。

2.2 最小抑菌濃度的測定：對具有抑菌作用的甘草、薄荷、烏梅和山楂水提液進行最小抑菌濃度（MIC）的測定結果為，烏梅對幽門螺桿菌的最小抑菌濃度為10mg/ml，菊花為15mg/ml，薄荷為20mg/ml，蒲公英為30 mg/ml，甘草的MIC最大為50mg/ml。

3 討論

本研究結果看出蒲公英，甘草，薄荷，烏梅和菊花對幽門螺桿菌都有不同程度的抑制作用，并且在很小濃度的范圍內就可以安全抑制其生長。因此，本研究不僅可以為研究開發抑制幽門螺桿菌的中藥提供原料，也可以為Hp常年攜帶者提供一個通過飲食來預防疾病發生的思路。