白樺酸體外對人肝癌細胞、鼻咽癌細胞增殖及組織血管生成的影響

黃荷云，周堯遠，張榮軍，蔡剛明，顧曉波，潘棟輝，蔣孟軍

(1江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇無錫 214063；2衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室；3江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室；4南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院)

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白樺酸體外對人肝癌細胞、鼻咽癌細胞增殖及組織血管生成的影響

黃荷云1,2,3，周堯遠1,2,3，張榮軍1,2,3，蔡剛明1,2,3，顧曉波1,2,3，潘棟輝1,2,3，蔣孟軍4

(1江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇無錫 214063；2衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室；3江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室；4南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察白樺酸(BA)對腫瘤細胞增殖及組織血管生成的影響。方法 培養(yǎng)人肝癌細胞株Bel-7402、人鼻咽癌細胞株CNE、人血管內(nèi)皮細胞株HMEC，分別以不同濃度的BA干預，比較Bel-7402細胞和CNE細胞增殖抑制率、凋亡率，并比較HMEC細胞增殖抑制率、遷移能力、血管形成能力。結果BA可抑制Bel-7402細胞、CNE細胞增殖，促進其凋亡，且呈劑量依賴性(P均<0.05)；BA可抑制HMEC細胞增殖，減弱遷移能力及血管形成能力，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。結論 BA可抑制人肝癌細胞、鼻咽癌細胞增殖及腫瘤組織血管生成。

關鍵詞：白樺酸；人肝癌細胞；人鼻咽癌細胞；人血管內(nèi)皮細胞

血管生成是實體腫瘤生長的決定性因素，腫瘤細胞通過腫瘤血管獲得營養(yǎng)與氧氣供應，因此抗腫瘤血管生長已成為腫瘤治療的研究熱點。白樺酸(BA)是從多種植物中分離得到的一種五環(huán)三萜類化合物，在自然界中分布廣泛。早期研究發(fā)現(xiàn)，BA對黑色素瘤有細胞毒性作用；近期研究發(fā)現(xiàn),BA具有抗人類免疫缺陷病毒活性、抗炎癥和廣譜抗腫瘤作用，且存在作用機制特異、分子質(zhì)量小、低毒性等優(yōu)點[1～7]。本研究觀察了BA對腫瘤細胞增殖及組織血管生成的影響，為進一步研究BA在血管生成中的機制提供理論基礎。

1材料與方法

1.1藥物、試劑及儀器BA；人血管內(nèi)皮細胞株HMEC由法國國家衛(wèi)生醫(yī)學研究院惠贈；人肝癌細胞株Bel-7402，人鼻咽癌細胞株CNE；磺酰羅丹明B(SRB)，內(nèi)皮細胞生長因子(EGF)；Matrigel；RPMI1640、MCDB-131培養(yǎng)基、胎牛血清；小牛血清；胰酶；細胞培養(yǎng)板。倒置顯微鏡；酶標儀；CO2培養(yǎng)箱。

1.2細胞培養(yǎng)Bel-7402細胞、CNE細胞用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清、1%雙抗)培養(yǎng)，HMEC細胞用MCDB-131培養(yǎng)液(含10%小牛血清、1%雙抗、1 mg/L氫化可的松、10 μg/L EGF)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱設置條件為37 ℃、5%CO2。

1.3Bel-7402細胞和CNE細胞增殖、凋亡情況觀察①細胞增殖情況：取對數(shù)生長期Bel-7402細胞、CNE細胞，分別接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，每個濃度設4個平行孔，培養(yǎng)過夜。鋪Bel-7402細胞的96孔板中分別加入0、5、10、12、14、16、18、20、30 mg/L的BA，鋪CNE細胞的96孔板中分別加入0、5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L的BA。培養(yǎng)72 h后去掉上清液，加入100 g/L三氯醋酸固定1 h后用去離子水洗5遍干燥。4 g/L SRB染色，室溫放置30 min，用1%醋酸液洗5遍，加150 μL的10 mmol/L Tris(pH 10.5)溶解，酶標儀在波長531 nm測定吸光度。計算細胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(1-實驗組A值)/對照組A值]×100%。②細胞凋亡情況：取對數(shù)生長期Bel-7402細胞、CNE細胞，接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24 h，后在Bel-7402細胞的96孔板中分別加0、5、10、20、40、60 mg/L的BA，CNE細胞的96孔板中分別加0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA，24 h后加Hochest33342和PI，其終濃度均為10 mg/L，培養(yǎng)10 min后，熒光顯微鏡觀察細胞的形態(tài)并拍照。

1.4HMEC細胞增殖情況、遷移能力、血管形成能力觀察①細胞增殖情況：取對數(shù)生長期HMEC細胞，分別接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，每個濃度設4個平行孔，培養(yǎng)過夜。鋪HMEC細胞的96孔板中分別加入0、5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L的BA。培養(yǎng)72 h后去掉上清液，加入100 g/L三氯醋酸固定1 h后，用去離子水洗5遍干燥。4 g/L SRB染色，室溫放置30 min，用1%醋酸液洗5遍，加150 μL的10 mmol/L Tris(pH 10.5)溶解，酶標儀在波長531 nm測定吸光度。計算細胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(1-實驗組A值)/對照組A值]×100%。②細胞遷移能力：取對數(shù)生長期HMEC細胞，以2×108/L的細胞接種于24孔板中，每孔2 mL，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用剪平的槍頭在鋪有細胞的24孔板中間劃線，培養(yǎng)液洗滌3次，洗去劃下的細胞，分別加入0、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA。72 h后，在倒置顯微鏡下觀察并用顯微鏡拍照，Image Pro Plus6.0軟件計算劃痕區(qū)域細胞的面積。③細胞血管形成能力：實驗材料先在4 ℃冰箱中預冷，取50 μL的Matrigel加入96孔培養(yǎng)板中，37 ℃孵育4 h待其凝固。分別取BA、含15%血清的MCDB-131培養(yǎng)液和HMEC細胞(4×104個/孔)混勻后加入到96孔培養(yǎng)板中，BA終濃度為0、6.25、12.5、25、50 mg/L。培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察血管形成。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Bel-7402細胞、CNE細胞增殖抑制率比較BA濃度為5、10、12、14、16、18、20、30 mg/L時，Bel-7402細胞增殖抑制率分別為0.5%、5.0%、28.9%、43.0%、58.8%、76.3%、86.2%、93.1%。BA濃度為5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L時，CNE細胞增殖抑制率分別為51.7%、72.7%、78.5%、90.0%、92.7%、93.6%、95.0%、95.3%。BA對Bel-7402細胞和CNE細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.2Bel-7402細胞、CNE細胞凋亡率比較Bel-7402細胞分別加入0、5、10、20、40、60 mg/L的BA，其凋亡率分別為8.0%、11.2%、24.0%、67.2%、82.4%。CNE細胞分別加入0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA，其凋亡率分別為1.6%、4.9%、6.1%、11.1%、59.9%。BA對Bel-7402細胞和CNE細胞的凋亡有明顯的促進作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.3HMEC細胞增殖抑制率比較BA濃度為5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L時，Bel-7402細胞增殖抑制率分別為27.4%、55.9%、61.7%、69.5%、73.7%、78.2%、78.3%、79.1%，BA對HMEC細胞增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.4HMEC細胞遷移能力比較BA濃度為6.25、12.5、25、50 mg/L時，HMEC細胞遷移抑制率分別為3.7%、12.7%、13.0%、18.2%。BA對HMEC細胞遷移能力有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.5HMEC細胞血管形成能力比較加入0 mg/L BA的HMEC細胞形成了典型的細胞網(wǎng)絡，內(nèi)皮細胞之間排列有序，組成一個個環(huán)狀管腔結構；而加入6.25 mg/L BA時，血管形成受到抑制；當BA濃度提高到12.5 mg/L時，內(nèi)皮細胞小管不能形成完整的環(huán)狀結構；BA濃度為50 mg/L時，內(nèi)皮細胞幾乎無移動，也不能形成管狀結構。

3討論

1971年，F(xiàn)olkman[8,9]首次提出腫瘤生長依賴于新血管生成的假說，后來隨著毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)技術的研究和血管生成劑的發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管成為腫瘤治療的新靶點。腫瘤的生長從無血管的緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤細胞獲得足夠營養(yǎng)物質(zhì)而快速增殖，尋找一種能抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成的藥物成為腫瘤研究的熱點。中藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥庫，在腫瘤治療方面有獨特的優(yōu)勢。BA是一種從白樺樹樹皮中提取的醇類化合物，能抑制上皮細胞和黑色素瘤細胞的增殖，對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用，是一個非常有前途的新化療藥物。Damle等[10]報道，BA能抑制MCF-7細胞的增殖、遷移，其IC50為13.5 mg/L，可延遲模型鼠腫瘤的形成。也有學者報道[11]，BA通過線粒體膜電位下降以及上調(diào)死亡受體等誘導了多種腫瘤細胞的凋亡。本研究顯示，BA在體外不僅抑制Bel-7402細胞、CNE細胞增殖，并誘導細胞凋亡，且呈明顯的劑量依賴性。腫瘤細胞的遷移活性是評價腫瘤惡化程度的最重要生物學指標之一，也是影響腫瘤治療效果和預后判斷的重要因素[12]，因此抑制腫瘤的遷移是治療腫瘤的關鍵。本研究顯示，BA在體外抑制了HMEC細胞的增殖和遷移，而且隨BA濃度增加，其抑制作用增強。

Matrigel是一種由EHS小鼠肉瘤細胞分泌，富含各種促進血管新生因子的細胞外基質(zhì)，可提供三維空間環(huán)境，便于內(nèi)皮細胞分化成類似新微血管網(wǎng)狀的管腔，模擬血管新生作用的過程。Matrigel實驗表明，BA能抑制內(nèi)皮細胞管腔的形成，從而為誘導腫瘤細胞凋亡、死亡及抑制腫瘤組織血管生成提供了有力佐證。我們前期實驗[13]曾報道23-羥基白樺酸對HMEC細胞的作用，證實其有明顯體外抗血管生成作用。本研究說明，BA也同樣具有體外抗血管生成作用，且抑制效果比23-羥基白樺酸更明顯。因此，BA體外可顯著抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，并且減弱細胞的遷移及抗血管生成的作用，其有可能成為一個具有較好應用前景的抗腫瘤血管生成藥物。

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Effects of Betulinic acid in vitro on proliferation and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma cells and nasopharyngeal carcinoma cells

HUANGHeyun1,ZHOUYaoyuan,ZHANGRongjun,CAIGangming,GUXiaobo,PANDonghui,JIANGMengjun

(1JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Jiangsu214063,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Betulinic acid (BA) in vitro on the proliferation and angiogenesis of tumor cells. MethodsThe human hepatocellular carcinoma cells (Bel-7402), human nasopharyngeal carcinoma cells (CNE) and human microcapillary endothelial cells (HMEC) were intervened by different concentrations of BA. The proliferation inhibition rates and apoptosis rates of Bel-7402 cells and CNE cells were compared. In addition, the proliferation inhibition rate, migratory ability and angiogenesis of HMEC cells were compared.Results BA inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of Bel-7402 cells and CNE cells, which were in a dose-dependent manner (all P<0.05). BA also inhibited the proliferation and reduced the migratory ability and angiogenesis with a dose-dependent manner (all P<0.05).ConclusionBA can inhibit the proliferation and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma cells and human nasopharyngeal carcinoma cells.

Key words:Betulinic acid; human hepatocellular carcinoma cells; human nasopharyngeal carcinoma cells; human vascular endothelial cells

(收稿日期:2015-09-13)

中圖分類號：R979.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.002

通信作者簡介：蔣孟軍(1972-)，男，本科，副研究員，主要研究方向為細胞生物學與核醫(yī)學。E-mail： jmj16888@126.com

作者簡介：第一黃荷云(1974-)，女，大專，主管藥師，主要研究方向為藥學。E-mail： whyjzx@126.com

基金項目：江蘇省衛(wèi)生廳基金資助項目(H200735)。