高效液相色譜法對生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定

孫彩華　　付　迎　　蔣毅超.浙江中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科，浙江杭州　30004；.正大青春寶藥業有限公司，浙江杭州　3003

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高效液相色譜法對生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定

孫彩華1付迎2蔣毅超2
1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科，浙江杭州310004；2.正大青春寶藥業有限公司，浙江杭州310023

[摘要]目的探究和分析高效液相色譜（HPLC）法對生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定。方法應用HPLC法，優化色譜條件，色譜柱采用Agilent 1100 C18（5μm，4.6 mm×250mm），流動相選擇乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78），檢測波長是203 nm，色譜柱溫度為30℃，流速1mL/min，計算回收率采用的是外標法，按峰面積計算。結果人參皂苷Rg1在0.0412～0.412μg范圍內與其峰面積呈現良好線性關系（r=0.999 96），其平均回收率達97.88%（RSD=1.06%）；人參皂苷Re在0.1618～1.618μg范圍內與峰面積呈現良好線性關系（r=0.999 98），平均回收率達98.21%（RSD=1.16%）。結論HPLC法操作簡單、快速，所得結果準確，適用于生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定。

[關鍵詞]高效液相色譜；生脈膠囊；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；含量測定

生脈膠囊主要由人參、麥冬、五味子經科學方法精制而成，具有益氣復脈、養陰生津的功效，臨床上主要應用于休克、冠心病、心力衰竭等疾病的治療[1-3]。方中人參為君藥，能夠大補元氣、復脈固脫、生津益肺、安神益智，是生脈膠囊發揮療效的重要組成部分。人參的主要活性成分有20多種[4]，包括人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd等[5-6]，這些人參皂苷的含量與人參的療效密切相關。《中國藥典》（2010版）明確提出將人參皂苷Rg1與Re作為測定制劑中含有人參分量多少的指標，測定藥材中人參皂苷Rg1和Re含量成為評估藥品優劣及判定給藥劑量的重要環節[7]。人參皂苷Rg1和Re含量的測定方法很多，包括薄層層析法、分光光度法、比色法等，近年來高效液相色譜（HPLC）法以其速度快、操作簡單、結果準確等優點而被用于人參皂苷Rg1和Re含量的測定，取得了較為滿意的效果[8]。本研究通過HPLC法測定人參皂苷Rg1 和Re的含量，為生脈膠囊的質量控制提供有效方法，具體報道如下：

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100系列高效液相色譜議（濟南上地電子科技有限公司）包括：四元泵、真空脫氣泵、柱溫箱、VWD檢測器，自動進樣器，Agilent化學工作站；Bolong USC-502超聲清洗機（濟寧萬和超聲電子設備有限公司）；BS224S電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；LD5000/6S多效蒸餾水機（吉林省華通制藥設備有限公司）。

1.2藥物與試劑

生脈膠囊（正大青春寶藥業有限公司；規格：0.3g/粒；批號：20140702、20140710、20140716）；人參皂苷Rg1對照品（中國藥品生物制品檢定所；批號：110703-201027，含量測定用）；人參皂苷Re對照品（中國藥品生物制品檢定所；批號：110754-201123，含量測定用）；甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為注射用水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent1100C18（5μm，4.6mm×250mm，），柱溫為30℃，將人參皂苷Rg1及Re的檢測靈敏度作為考慮因素，綜合判斷并選擇檢測波長為203 nm，流速為1mL/min，流動相為乙腈-0.1%磷酸（22∶78）。理論塔板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6000。對照品、供試品與陰性樣品的色譜圖見圖1。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備分別對10 g的人參皂苷Rg1對照品、10 g人參皂苷Re對照品進行精密的測量，后將其放置于10 mL容量瓶中，向其中加入甲醇使上述Rg1及Re對照品得到充分的溶解與搖勻。同樣，給予精密測量1.0mL的對照品溶液置入5mL容量瓶中，向其中加入甲醇至刻度并搖勻，作為對照品溶液存放在4℃的冰箱中。

2.2.2供試品溶液的制備取30粒生脈膠囊進行研細并混勻，取其中3.0 g左右給予精密稱定，將其放置于具塞錐形瓶中，向其中加入25mL的70%乙醇溶液后給予密塞，常規進行0.5 h的超聲處理，將超聲功率及頻率分別設置在250W、50 kHz，濾過處理（必要時先離心再濾過）。采用20mL的70%乙醇溶液對容器及濾器進行清洗，蒸干后向殘渣中加水20mL幫助其溶解，采用水飽和的正丁醇振搖提取5次，第1次劑量為20mL，第2次劑量為20mL，第3次劑量為20mL，第4次劑量為15 mL，第5次劑量為15 mL，合并正丁醇提取液，放置在水浴上蒸干，向殘渣中加入適當的甲醇適量促進溶解，后將其轉移至10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度后搖勻。對該溶液使用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，將其作為供試品溶液存放在4℃的冰箱中保存。

2.2.3陰性樣品溶液的制備按生脈膠囊處方組成取除去人參藥材外的藥材和輔料，按生脈膠囊的制備工藝和供試品溶液的制備制成陰性對照溶液。2.3線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液（人參皂苷Rg1和Re），吸取的劑量分別為1、5、10、15、20、25、30μL注入到液相色譜儀中。按“2.1”項下色譜條件進行分析并對峰面積進行測定。分別以峰面積、對照品溶液含量作為縱坐標及橫坐標，繪制成標準曲線后給予回歸計算。計算所得回歸方程，人參皂苷Rg1：Y= 4615.25 X-126.31（r=0.999 96），結果提示，人參皂苷Rg1在0.0412～0.412μg之間具有良好的線性關系。結果得人參皂苷Re的回歸方程Y=3906.13 X-225.62 （r=0.999 98），提示人參皂苷Re在0.1618～1.618μg之間具有良好的線性關系。

圖1　對照品、供試品與陰性樣品的色譜

2.4方法學考查

2.4.1精密度試驗取批號為20140710生脈膠囊的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件注入高效液相色譜儀連續進樣6次，每次10μL，依法測定。計算人參皂苷Rg1峰面積的RSD 為1.20%；人參皂苷Re峰面積的RSD為1.03%，表明精密度良好。

2.4.2穩定性試驗取該生脈膠囊的同一批供試品（批號：20140710），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h進樣10μL，測定峰面積，計算人參皂苷Rg1峰面積的RSD為1.65%；人參皂苷Re峰面積的RSD為1.74%，表明供試品溶液在8 h內穩定。2.4.3重復性試驗選取同一批供試品該生脈膠囊（批號：20140710），一共6份，完全按照按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并在相同的色譜條件下測定，后準確計算人參皂苷Rg1及Re的質量分數。結果提示，在樣品中人參皂苷Rg1平均含量為0.6859mg/mL，RSD 為1.10%；人參皂苷Re平均含量為0.2605mg/mL，RSD 為1.23%（n=6）。結果表明本方法重復性良好。

2.4.4加樣回收率試驗取該生脈膠囊的同一批供試品（批號：20140710）適量，研細，精密稱取粉末6份，每份約1.50 g，精密稱定，分別精密加入人參皂苷Rg1對照品和人參皂苷Re對照品，按“2.2.2”項下方法制得加樣回收試驗的供試品溶液，每次進樣10μL，按上述色譜條件測定，計算回收率，取平均值，人參皂苷Rg1的平均加樣回收率為97.88%，人參皂苷Re的平均加樣回收率為98.21%。見表1。

表1　人參皂苷R g 1和R e加樣回收率試驗結果（n=6）

2.5樣品的測定

分別選取該生脈膠囊的3批樣品（批號分別為20140702、20140710、20140716），按照上述方法給予精密稱定，同時按照上述“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液，按外標法計量樣品中人參皂苷Rg1和Re的含量，結果見表2。

表2　生脈膠囊中人參皂苷R g 1和R e含量測定結果（n=3）

3　討論

3.1色譜柱的選擇

有資料證實，HPLC法的色譜柱越長，所需要的流速就越大，使用的流動相的量就越多，這樣色譜柱就越高，因此，選擇短的色譜柱較為合理[9]。而筆者分析以15 cm和25 cm長度的色譜柱進行分離，結果兩種長度的色譜柱均能分離樣品中人參皂苷Rg1和Re，且都達到了1.5倍以上的分離度[10]。鑒于兩種長度色譜柱都達到了想要的分離效果，筆者認為長度為15 cm的色譜柱更為合適。

3.2提取方法的選擇

筆者先查閱了文獻及藥典，并先后嘗試采用萃取法、大孔吸附樹脂柱、中性氧化鋁柱或大孔吸附樹脂柱與中性氧化鋁柱共同參與等各種要求下的層析法提取生脈膠囊中的人參皂苷Rg1和Re，相比之下，對人參皂苷Rg1和Re的選擇性較高且干擾性小的方法是萃取法，且萃取法專屬性好，研究員認為萃取法制備供試品所達到的效果更為滿意。

3.3流對相的選擇

為了達到人參皂苷Rg1和Re檢測要求，需要減少液相色譜儀檢測的干擾雜質，所以脫脂所用溶液的選擇同樣重要，筆者對比了應用三氯甲烷、乙醚以及三氯甲烷和乙醚按照9∶1、3∶1、2∶1、1∶1比例組合后的溶液進行提取脫脂，結果發現三氯甲烷與乙醚按照3∶1比例混合的溶液進行提取脫脂后在液相色譜儀檢測到的干擾成分是這些成分中最少的，用此比例脫脂非常合適[11-12]。

3.4流動相及柱溫的選擇

筆者曾選用《中國藥典》2010年版（一部）人參含量測定項下所用乙腈-水的洗脫方法，但譜峰拖尾較嚴重，分離效果不理想。后采用文獻報道的乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸為流動相，發現以乙腈-0.1%磷酸（22∶78）作為流動相，對樣品的分離較好[13]。進一步摸索發現流動相中乙腈濃度變化對人參皂苷Rg1和Re分離度的影響不容忽視，如果乙腈的濃度在19%（0～35 min）能使人參皂苷Rg1和Re的分離度達到1.5倍以上，但是存在干擾峰，若將乙腈設定為19%～28%（35～50 min）時，避免干擾峰的影響，人參皂苷Rg1和Re的分離度也相應提高[14-15]。筆者在此基礎上，對柱溫進行考察，分別將柱溫設置在20、25、30℃，進行檢測后發現柱溫為30℃時液相色譜儀的分離度明顯比20℃和25℃時所得的結果要好，所以30℃為較合適的色譜柱溫度。

本研究選擇生脈膠囊為供試品的原材料，生脈膠囊中所含人參對于其藥效的發揮起著重要作用，人參發揮藥理作用主要是因為含有活性成分——人參皂苷[16]。人參皂苷是固醇類化合物，關于人參皂苷的提取分離方法是近年來相對研究較多的一個領域[17]。HPLC法作為新型的檢測物質成分的方法，已經被廣泛應用和開展，HPLC法的靈敏度高、測量結果準確，并且具有操作簡單、檢測速度快的優點[18-19]。本研究通過多次試驗優化了HPLC法的條件，在色譜柱、流動相、柱溫、提取方法等工藝發面進行多次的嘗試并選擇最優的條件，對人參皂苷Rg1和Re含量的測定取得了良好的效果，總結研究所得的成果，HPLC法以其多個優勢而用于測定人參皂苷Rg1和Re的含量，供生產工藝改造和質量標準的制訂作出參考。

對本研究中存在的不足進行分析，HPLC法在人參皂苷Rg1和Re的測量中已經達到了很高的分離標準，提高了檢測的精確性，但是，HPLC法操作過程所用儀器的成本較高，昂貴的價格限制了它在一些地區的應用，其在各地普及還需要一定的時間和經濟條件。近年來以HPLC法為基礎，已經出現液-質聯用高效液相色譜（HPLC-MS/MS）法、超高效液相色譜（UPLC）法等新技術，這些新方法同樣用于有效成分的測量，液-質聯用高效液相色譜（HPLC-MS/MS）法能夠同時測量人工皂苷Rg1和Re的檢測，超高效液相色譜法則比高效液相色譜法的檢測靈敏度更高、檢測速度更快、操作也更為簡單，不失為人參皂苷Rg1 和Re的更好辦法，超高效液相色譜法值得我們做進一步的探討[20-23]。本研究只針對人參中人參皂苷Rg1 和Re兩種活性成分進行測定，而其主要活性成分有20多種，有關人參中其他類型人工皂苷含量的檢測方法也有文獻記載，但是有些種類的檢測技術還在研究探索階段，后續可以對人參中其他活性成分的檢測做進一步的研究。

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Determ ination of Ginsenoside Rg1 and Ginsenoside Re in Shengmai Capsules by HPLC

SUN Caihua1FU Ying2JIANG Yichao2
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Province, Hangzhou310004,China;2.Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co.Ltd.,Zhejiang Province,Hangzhou310023, China

[Abstract]Objective To develop a HPLCmethod for determination of ginsenosides Rg1&Re from Shengmai Capsule. M ethods The separation was performed on Agilent 1100 C18(5μm,4.6 mm×250 mm)column eluted with themobile phase consisting of acetonitrile and-0.1%phosphoric acid solution(22∶78)at the flow rate of 1mL/min.The detection wavelength was 203 nm and the column temperature was 30℃,extemal standard method was used tomeasure recovery according to the peak area calculution.Results Ginsenoside Rg1 had a good linear relationship with the peak area within 0.0412-0.412μg(r=0.999 96),the average recovery was 97.88%(RSD=1.06%);Ginsenoside Re had a good linear relation with the peak area within 0.1618-1.618μg(r=0.999 98),the average recovery was 98.21%(RSD= 1.16%).Conclusion The HPLCmethod is simple,rapid and accurate,which is suitable for the determination of Ginsenoside Rg1&Re from Shengmai Capsule.

[Key words]High performance liquid chromatography;Shengmai Capsules;Ginsenosides Rg1;Ginsenoside Re;Determination

收稿日期：（2015-09-18本文編輯：趙魯楓）

[作者簡介]孫彩華（1974-），男，浙江中醫藥大學2013級中藥學專業在讀碩士研究生，副主任中藥師；主攻方向：藥物鑒定與臨床藥學。

[基金項目]浙江省中醫藥科技立項課題（2015ZB045）。

[中圖分類號]R927.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0009-04