基于殼仁分離的水飛薊提取純化工藝

孫小祥， 譚才宏， 陳 鈞， 張業旺， 夏國華*（1.鎮江市中醫院藥劑科，江蘇鎮江100；.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江101；.江蘇大學附屬醫院藥劑科，江蘇鎮江1001）

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基于殼仁分離的水飛薊提取純化工藝

孫小祥1，2， 譚才宏3， 陳 鈞2， 張業旺2， 夏國華2*
（1.鎮江市中醫院藥劑科，江蘇鎮江212003；2.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013；3.江蘇大學附屬醫院藥劑科，江蘇鎮江212001）

摘要：目的 研究在殼仁分離條件下，以水飛薊制備純化水飛薊賓的工藝。方法 水飛薊脫殼后，其殼的乙酸乙酯提取物用乙醇洗脫純化，并以水飛薊賓純度和得率為指標，采用中心組合設計-響應面法優化工藝。結果 最佳條件是以80%乙醇為洗脫溶劑，液固比1.1，洗脫4次，所得水飛薊賓純度為82%，得率為80%。70%乙醇重結晶后，其含有量為97.3%，產率為1.090%。結論 該工藝可提高水飛薊的綜合利用，而且簡單可行，成本低廉，具有很好的工業應用價值。

關鍵詞：水飛薊；水飛薊賓；殼仁分離；中心組合設計-響應面法

中藥水飛薊Silybi Fructus為菊科水飛薊屬植物水飛薊Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟瘦果，作為經濟作物，由德國引種入我國，并被《中國藥典》收錄［1］。其主要有效成分水飛薊賓（si1ybin，SLB）為理想的肝損傷修復藥物［2-3］，市場需求量極大，目前已經有水飛薊賓片劑、膠囊、脂質體等多種制劑上市。

水飛薊的果皮（水飛薊殼）與種仁（水飛薊仁）比重接近，但在化學成分和生物活性上有很大的差異［4-6］，水飛薊賓主要分布于果皮中，而在種仁中的含有量極低［7］，但水飛薊瘦果果皮堅硬，對種仁包裹緊密，脫殼困難。目前，生產上主要是將水飛薊冷軋取油，以壓榨后的水飛薊粕提取水飛薊素，進一步純化后得到水飛薊賓［8］，但該工藝提取率低，生產周期長，單位能耗高［9］。因此，為了實現水飛薊資源的高效綜合利用，本實驗以水飛薊的殼仁分離技術為基礎，建立一種新型的提取純化工藝，為制藥工業中水飛薊賓的生產提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 水飛薊脫殼機（本實驗室專利［10］）；TG328A電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；I-205旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；UV2401紫外-可見分光光度計、LC-20A HPLC色譜儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 材料 水飛薊藥材（江蘇中興藥業有限公司），由江蘇大學藥學院陳紅霞副教授鑒定為菊科植物水飛薊Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟果實，標本（編號SP20121101）保存于江蘇大學藥學院標本室。水飛薊賓對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號0856-201203，經HPLC測定，純度≥98%）。甲醇為色譜純（江蘇漢邦化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 水飛薊賓含有量測定［1，11］

2.1.1 溶液配制 精密稱取水飛薊賓對照品32.0 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得對照品貯備液。再精密稱取水飛薊賓粗品或精制品35.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇定容，即得供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 Venusi1ASB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-2.0%冰醋酸水溶液（45∶55）；進樣量20 μL；體積流量1.0 mL/min；檢測波長288 nm；柱溫室溫。

2.1.3 標準曲線 精密吸取貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣測定。以質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程Y＝61 043X-20 548，r＝0.999 5，表明水飛薊賓在1.888～11.328 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 樣品測定 精密吸取樣品溶液5.0 mL，按“2.1.3”項下方法操作。

2.2 水飛薊瘦果殼仁分離 取干燥的水飛薊藥材3 kg，以1 kg/m in的速率勻速加入脫殼機中，200目尼龍袋在出料口收集脫出物。將其用16目篩除去粉碎物后（稱定質量，計算粉碎率），振動篩選出未脫殼的藥材（稱重，計算脫殼率），再經風選以實現殼與仁的分離，備用。

2.3 水飛薊賓粗提物制備 將水飛薊殼粉碎，過40目篩，精密稱取15.0 g，加乙酸乙酯90 mL，80℃回流2 h，抽濾，濾渣同法再提取一次，合并濾液，減壓濃縮回收溶劑，石油醚（60～90℃）洗滌浸膏2次，揮干石油醚，即得［12］。

2.4 粗提物的純化 精密稱取水飛薊賓粗提物5.0 g，加入一定比例的乙醇溶液，渦旋1 min，靜置5 min后離心，烘干離心固體，稱定質量，HPLC法測定水飛薊賓的純度，得到優質的水飛薊提取物原料（水飛薊素）或水飛薊賓原料中間體。

根據中心組合設計原理，以Z（水飛薊賓的得率× 50%＋水飛薊賓的純度×50%）為響應值，以影響SLB純化的乙醇體積分數、液固比為自變量，進行兩因素五水平的響應面分析試驗［13］，結果見表1。

表1 試驗因素和水平

2.5 水飛薊賓精制 取水飛薊賓原料中間體5.0 g，加無水乙醇200 mL，加熱回流3 h溶解，緩慢加入微沸水86 mL稀釋后，繼續回流1 h，放冷，4℃冰箱放置過夜，離心，收集析出物，60℃下烘干。按比例重復上述過程，HPLC法測定水飛薊賓含有量，按下式計算產率。

2.6 對比試驗［12］取水飛薊原藥材50 g，按照傳統冷軋提取工藝制備水飛薊賓。另取原藥材冷軋去油，得到水飛薊粕后，參照本工藝同法操作，計算產率，并與本工藝進行比較。

3 結果與分析

3.1 HPLC色譜圖 按“2.1.3”和“2.1.4”項下方法操作，得到水飛薊賓對照品、粗提物和精制品的HPLC色譜圖，見圖1。

圖1 水飛薊賓產物HPLC圖

3.2 殼仁分離效果 采用自制水飛薊脫殼機，脫殼率95%以上，粉碎率小于3%，脫殼效果見圖2。

圖2 水飛薊脫殼效果圖

3.3 響應面優化純化工藝 試驗結果見表2。

表2 試驗結果

采用Design Expert 8.05軟件，對表中的Z項數據進行多元回歸擬合，得到回歸方程Z＝-2.185 9＋1.435 1A＋0.056 2B＋0.010 1AB-1.035 8A2-0.000 4B2。方差和可信度分析見表3、表4。

表3 方差分析結果

表4 回歸方程可信度分析

由表3、表4可知，該模型失擬項顯著（P＜0.05），而決定系數（P＞0.05）不顯著，說明方程的擬合度和可信度均良好。另外，因素A、A2、B2對試驗結果影響顯著，而B和交互項AB影響不顯著，故該模型可用于水飛薊粗提物的純化。

由響應面分析圖（圖3）可知，水飛薊提取物的最佳純化工藝為79.39%乙醇，液固比1.08，洗脫4次。

圖3 響應面分析圖

以80%乙醇為洗脫溶劑，液固比1.1，洗脫4次，平行3次進行驗證試驗，結果見表5，得Z值為0.819 8 （ISD為0.13%），接近預測值0.820 2，說明該模型可靠。在該工藝條件下，水飛薊賓純度為82%，得率為80%，故可作為優質的水飛薊提取物原料或水飛薊賓中間體產品。

表5 模型驗證試驗

3.4 水飛薊賓精制結果 取最優工藝下3批水飛薊賓中間體原料，按“2.5”項下方法進行重結晶操作，結果見表6。

表6 高純度水飛薊賓精制結果

3.5 對比試驗結果 按照本工藝操作，從50 g水飛薊原藥材中制備的水飛薊賓產率為1.18%，而傳統工藝下為0.73%。

4 結論與討論

本實驗比較了硅膠柱色譜層析法、D101大孔吸附樹脂法和重結晶法對水飛薊賓粗提物精制的效果。結果發現，硅膠柱色譜精制水飛薊賓的純度最高，但是需用大量溶劑，成本較高，產率較低，而大孔吸附樹脂的純度較低。因此，本實驗選擇重結晶法。

水飛薊賓常用的重結晶溶劑一般有甲醇、乙酸乙酯、丙酮以及混合溶劑系統，其中以甲醇和乙醇的精制產率為高［9］，考慮到甲醇的毒性，本實驗選擇乙醇作為重結晶溶劑。研究發現，乙酸乙酯粗提物雜質在無水乙醇中的溶解度遠大于水飛薊賓，兩者的質量濃度近似呈現5∶1～6∶1的關系。同時，水飛薊賓在70%乙醇中的溶解度較低（13.23 mg/mL），而該溶劑對雜質仍有理想的溶解能力（70.71 mg/mL）。因此，結晶時先用無水乙醇溶解水飛薊賓粗品中的雜質成分及部分水飛薊賓，再加水形成70%乙醇，使水飛薊賓的溶解度降低，進而析出該成分，而雜質成分未達到飽和，并不析出，以達到除雜的目的。

另外，本實驗對純化后的乙醇洗脫液進行LC-MS分析，發現其中含有二氫槲皮素、水飛薊亭、水飛薊寧、水飛薊賓、異水飛薊賓等成分，為后續從該結晶液中回收各活性單體提供參考。

綜上所述，本實驗將中藥水飛薊脫殼后，制備優質的水飛薊提取物和高純度水飛薊賓，該工藝以水飛薊綜合利用為宗旨，簡單可行，成本低廉，具有較高的工業應用價值。

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*通信作者：夏國華，男，實驗師，研究方向為中藥提取及分離。E-mai1：xgh-78131@yeah.net

作者簡介：孫小祥（1972—），男，碩士，副主任藥師，研究方向為生藥資源。E-mai1：412354487@qq.com

基金項目：鎮江市科技計劃項目（HS2014069）；江蘇省藥學會—百特生物藥學基金（201543）

收稿日期：2015-03-17

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.046

中圖分類號：I284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）02-0686-04