基于X射線衍射指紋圖譜鑒別龍骨

崔曉慧， 陳 龍， 劉義梅， 黃必勝， 陳科力（湖北中醫藥大學，教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室，湖北武漢430065）

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基于X射線衍射指紋圖譜鑒別龍骨

崔曉慧， 陳 龍， 劉義梅， 黃必勝， 陳科力*
（湖北中醫藥大學，教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室，湖北武漢430065）

摘要：目的 建立X射線衍射指紋圖譜對龍骨進行鑒別。方法 應用粉末X射線衍射技術，對11批龍骨和3批煅龍骨樣品進行分析，以優質龍骨樣品的X射線衍射平均圖譜為對照指紋圖譜，以共有特征峰為指紋峰，進行相似度評價和聚類分析。結果 以樣品的相關系數為相似度評價指標，龍骨正品的相似度大于0.83，而聚類分析結果亦可將正偽龍骨區分開，但這兩種方法不適用于關節處龍骨的鑒別。結論 該指紋圖譜可用于對龍骨的真偽鑒別，關節處除外。關鍵詞：龍骨；X射線衍射；指紋圖譜；相似度評價；聚類分析

KEY W 0RDS：Os Draconis；X-ray diffraction；fingerprint；simi1arity eva1uation；c1uster ana1ysis

龍骨（Os Draconis）為古代哺乳動物，如三趾馬、犀類、鹿類、牛類、象類等骨骼的化石或象類門齒的化石［1］，其性味甘、澀、平，歸心、肝、腎、大腸經［2］，生用可平肝潛陽、鎮驚安神，主治煩躁易怒、心悸失眠、頭暈目眩、癲狂驚厥等癥；煅用可收斂固澀，主治遺精早泄、崩漏、虛汗、濕瘡癢疹、瘡口不斂及外傷出血等癥［3］，其主要成分為碳酸鈣、磷酸鈣，另含少量的鐵、鎂、鋁、鉀、鈉、氯、硫酸根等離子［4］。由于龍骨為動物骨骼多年形成的化石，是寶貴的不可再生資源，故現存量逐年減少，正品價格不斷增高，偽劣產品較多，如用風化的動物骨骼外包滑石粉或石炭粉來冒充龍骨［5］，而且骨骼在漫長的年代轉化為化石期間，還有很多中間類型，因此龍骨是市場上偽劣藥材較多的中藥品種之一。對于龍骨這類化石類藥材的鑒別，主要是依靠經驗性的性狀分析，其主觀性較強，一旦其被粉碎成粉末后，就很難再用常規的方法加以鑒別。因此，為保證藥材的質量，確保臨床療效，運用現代分析技術建立龍骨可靠的客觀鑒定方法是很有必要的。

X射線衍射法是分析和研究結晶物質的重要手段之一，由于礦物類中藥絕大多數由晶質礦物組成，因此采用該方法進行鑒定具有可行性［6-10］，文獻［11］對龍骨和龍齒建立了指紋圖譜以進行初步分析，并對真偽品進行了鑒定。通過比較發現，兩者的X射線衍射指紋特征有比較明顯的區別，故應當分別建立更為精細的指紋圖譜。但是，該文獻中生龍骨的樣品太少（只有2份），而且其圖譜分析尚未對市場上多種龍骨樣品的形式進行解讀。因此，本實驗采用X射線衍射法，對11批不同來源的龍骨及煅龍骨樣品進行分析，在建立正品龍骨X射線衍射指紋圖譜的基礎上，與各種龍骨樣品進行比較，并作進一步的分析研究。

1 材料與儀器

1.1 藥材 從不同藥材市場購得11批龍骨樣品，均由湖北中醫藥大學中藥鑒定教研室陳科力教授依據其性狀，進行了初步鑒別，詳細信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Inform ation of sam p les

1.2 儀器 X’PertPro型X射線粉晶衍射儀（荷蘭帕納科公司）；MID Jade6.5分析軟件；Origin8數據分析和繪圖軟件。

2 方法與結果

2.1 樣品制備 分別取11批龍骨樣品，干燥，粉碎，過200目篩，制成待測樣品。

煅制方法為將樣品S3、S4和S5的粉末置于坩堝內，再放到650℃馬弗爐中，2 h后取出冷卻，標記為樣品D3、D4和D5。

2.2 實驗條件及X射線衍射圖譜采集 入射光源為CuKα輻射；Ni片濾波；X光管工作電壓為40 kV；電流為40 mA；光闌系統為DS＝SS＝1°；IS＝0.3 mm。使用連續掃描方式，掃描速率為8°/min；2θ分辨率為0.02°；掃描范圍為3°～65°；采用超能探測器。

取少量樣品粉末，用玻璃板壓平于樣品板的凹槽中，按照儀器操作程序，采集各樣品粉末的X射線衍射原始圖譜，并導入MID Jade 6.5分析軟件中，對圖譜做11點平滑處理，得到各樣品的分析圖譜。

2.3 龍骨樣品的X射線衍射圖譜特征及分析

2.3.1 優質龍骨 應用Origin 8軟件處理，繪制S1～S4共4批優質龍骨樣品的X射線衍射共有模式圖，見圖1，發現其幾何拓撲圖形規律一致。利用JADE 6.0數字信號處理技術，對這些圖譜分別進行尋峰、物相檢索，查閱由國際粉末衍射標準聯合會負責編輯出版的“粉末衍射卡片PDF卡片”，初步判斷這其X射線衍射數據與PDF74-0565 （hydroxy1apatite）及PDF72-1937（ca1cite）基本一致，說明這些優質龍骨樣品主要含Ca10（PO4）6（OH）2（羥基磷灰石）與CaCO3（方解石型碳酸鈣），這與文獻［11-12］報道相符。另外，樣品S3與其他樣品相比，在2θ＝26.639°處多一個譜峰，與PDF79-1906一致，是石英（SiO2）的特征峰，其相對峰面積為34%，表明該樣品中石英含有量較低。將這4批優質龍骨X射線衍射圖譜中的峰疊加后平均，得到平均數圖譜，作為龍骨的對照圖譜，見圖2。由圖可知，2θ＝26.639°處是石英（SiO2）的特征峰，而并非龍骨的特征峰，故將其去掉。

圖1 4批龍骨正品的X射線衍射指紋圖譜Fig.1 X-ray diffraction fingerprints of four batches of genuine Os Draconis

圖2 4批龍骨正品的平均數圖譜Fig.2 M ean spectrum of four batches of genuine Os Draconis

2.3.2 關節位置處龍骨圖譜 樣品S5、S6為關節處龍骨，初步鑒定為龍骨正品，其X射線衍射圖譜的幾何拓撲圖形規律一致，見圖3。物相檢索結果表明，這2批龍骨樣品主要含羥基磷灰石與少量石英，不含方解石，與優質龍骨在物相組成和標準指紋圖譜上有較大差異，說明可能為龍骨偽品。但對已確證為龍骨的S3樣品關節部分S3-2的X射線衍射圖譜進行分析，發現其物相組成也與S5、S6完全一致，也含少量石英，不含方解石，即兩者也可能為龍骨正品。故根據X射線衍射圖譜，對S5、S6的鑒定結果為“龍骨存疑”，所以該方法不適合關節處龍骨樣品的鑒別，還有待作深入的探討。

2.3.3 煅龍骨 3批煅龍骨的X射線衍射圖譜見圖4。比較龍骨和煅龍骨的物相組成，發現D3與S3一樣，主要為羥基磷灰石與方解石，還含很少量的石英；D4與S4一樣，主要含羥基磷灰石與方解石；D5與S5一樣，主要含羥基磷灰石和少量石英，表明龍骨煅燒前后物相組成無明顯變化。比較龍骨煅燒前后的峰形發現，煅燒前，羥基磷灰石的特征峰鈍而寬，彌散嚴重［13-14］，說明該物相純度及結晶度較低；煅燒后，各衍射峰強度增強，底部寬度變窄，峰形變尖銳，說明煅燒后樣品的晶化程度大大提高。

圖3 2批關節處龍骨的X射線衍射圖譜Fig.3 X-ray diffraction fingerprints of tWo batches of Os Draconis in joints

圖4 3批煅龍骨的X射線衍射圖譜Fig.4 X-ray diffraction fingerprints of three batches of calcined Os Draconis

2.3.4 龍骨劣質品及摻偽品 樣品S7呈圓柱狀，石化明顯，表面有黏土，骨髓腔處被大量巖石填充，滴加稀鹽酸后迅速產生大量氣泡，故鑒定為骨髓腔填充巖石的龍骨，即劣質龍骨，其X射線衍射圖譜（圖5）亦反映出該樣品的龍骨組分特征。另外，其2θ＝29.413°（晶面間距d＝3.034 2 ?）處有一基峰（相對峰高I/I0＝100%），為方解石特征，表明該樣品含大量方解石，主要來自髓部填充的巖石；2θ＝26.639°（d＝3.343 5 ?）處有一尖峰，為石英特征，可推測其來自樣品表面附著的黏土。樣品S8、S9均為經過粉碎處理后的龍骨統貨，性狀特征不明顯，但仔細挑選后可見龍骨碎塊，亦有大量表面光滑、無石化特征的現代動物骨頭碎片，以及形如龍骨碎片的黏土塊，而且后者亦發現一些表面包裹一層龍骨粉黏土塊摻偽物，故兩者也為龍骨偽品，其X射線衍射圖譜見圖5。通過物相檢索，發現這2批樣品均有羥基磷灰石和方解石，為龍骨正品的主要成分，同時均含有大量石英，其衍射強度大于主要成分。另外，樣品S9還含有其他雜質礦物，如長石、石膏。

圖5 3批龍骨偽品的X射線衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction fingerprints of three batches of pseudo Os Draconis

2.3.5龍骨偽品的圖譜分析 龍骨樣品S10、S11無石化特征，故為偽品，其X射線衍射圖譜見圖6。通過物相檢索發現，樣品S10主要含羥基磷灰石和少量石英，不含碳酸鈣，由于羥基磷灰石的特征峰峰形尖銳，分裂明顯，與煅燒品類似，故推斷其為偽品；S11主要含羥基磷灰石，不含CaCO3，峰形彌散嚴重，樣品結晶性差。

2.4 龍骨XID圖譜指紋性分析

2.4.1 X射線衍射圖譜尋峰處理 利用JADE 6.0軟件，對4批優質龍骨的圖譜分別進行尋峰處理，經分析比較，選取強度較大的共有特征峰10個（圖2）作為龍骨特征指紋峰。然后，對其他樣品尋峰，得到各峰位值（2θ/°）和相對強度（I/I0），數據見表2。

表2 共有特征峰的峰位與相對強度Tab.2 Peak positions and relative intensities of common characteristic peaks

2.4.2 相似度計算 以圖2中4批龍骨正品的平均數圖譜為對照圖譜，采用相關系數法和夾角余弦法分別計算各批龍骨的相似度，結果見表3。由表可知，各類樣品的相似度由大到小依次為優質龍骨、優質煅龍骨、摻偽品、劣質品、偽品及關節處龍骨，可明顯加以區分。

表3 各批龍骨的相似度Tab.3 Sim ilarities of various batches of Os Draconis

2.5 聚類分析方法驗證 根據表3中各批龍骨樣品的10個共有峰數據，采用SPSS 19.0軟件進行系統聚類分析，結果見圖7。由圖可知，所有樣品被聚為兩類，樣品S1、S2、S3、S4、D3、D4、S7聚為一類，均為正品龍骨，包括骨髓腔中充填了巖石的S7，其中S1、S3，S2、S4，D3、D4當距離標尺為1時，緊密相聚；樣品D5、S5、S6、S8、S9、S10、S11聚為另一類，包括摻偽品S8、S9，偽品S10、S11，關節處樣品D5、S5、S6，其中S8、S9緊密聚類，其它聚為一類，說明關節處的龍骨樣品與偽品較難區分。以上結果與相似度分析基本一致，可用以明顯鑒別除關節處的各類龍骨樣品，也說明X射線衍射指紋圖譜可用于龍骨品質評價及真偽鑒別。

3 討論

本實驗對不同來源的11批龍骨樣品和3批煅龍骨樣品進行性狀鑒定和X射線衍射分析，建立了以4批優質龍骨樣品平均圖譜的10個共有特征峰為對照的龍骨X射線衍射指紋圖譜，可準確區分優質、劣質、摻偽、偽品等不同品質的龍骨及煅龍骨。

圖7 聚類分析圖Fig.7 Cluster analysis chart

實驗發現，相關系數法計算得到的相似度比夾角余弦法的差異更顯著，故采用相關系數法考察該指紋圖譜。結果，樣品S1、S2、S3、S4、D3、D4的相關系數均在0.83以上，為優質龍骨，而且煅品均小于生品，兩者可明顯區分。在優質龍骨中，樣品S3的相關系數偏低，其表面有少量黏土，可能在制樣過程中摻入；摻偽品的相似度略低于煅品（＜0.81），但大于劣質品S7（0.701 3），說明摻偽品的質量比劣質品好，這與其性狀特點相符。人為摻雜其他雜質的摻偽品中依然以優質正品龍骨為主，但S7天然伴生雜質的含有量卻大于藥用部位，致使其品質較摻偽差。研究發現，關節處龍骨及其煅品因與偽品在物相組成上都不含方解石，相似度均較低（＜0.55），所以不能通過相似度法區分開，這一結果也通過X射線衍射圖譜的聚類分析法得到了印證。由于在實際銷售和臨床使用中，并不存在將關節處龍骨單獨列出的情況，而是共同使用，故為避免其干擾，在應用X射線衍射指紋圖譜鑒別龍骨時，應避開關節處。

在聚類分析中還發現，當距離標尺為3時，劣質品S7與優質龍骨聚為一類，結合其性狀特點及物相組成，可說明天然形成的劣質品性狀及物相組成與優質品相似，僅各物相含有量存在差異，而摻偽品中帶入其他雜質，對藥材品質的影響更大。因此，對于S7之類的摻偽龍骨可敲碎，剔除伴生雜質礦物后再使用。

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［綜 述］

Identification of Os Draconis based on X-ray diffraction fingerprint

CUIXiao-hui， CHEN Long， LIU Yi-mei， HUANG Bi-sheng， CHEN Ke-1i*

（Key Laboratory of TraditionalChineseMedicineResourceand Compound Prescription，Ministry of Education，HubeiUniversity of ChineseMedicine，Wuhan 43OO65，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an X-ray diffraction fingerprint for the identification of Os Draconis.METH-0 DS The powder X-ray diffraction techno1ogy was used for ana1yzing e1even batches of Os Draconis and three batches of ca1cined Os Draconis.The simi1arity eva1uation and c1uster ana1ysisweremade with the average X-ray diffraction patterns of high qua1ity Os Draconis as reference fingerprint and common characteristic peaks as fingerprint peaks.RESULTS With the corre1ation coefficients of samp1es as eva1uation index，the simi1arity of genuine Os Draconis wasmore than 0.83，whi1e c1uster ana1ysis cou1d a1so distinguish genuine from pseudo Os Draconis.But these twomethods were not suitab1e for the identification of Os Draconis in joints.C0NCLUSI0N This fingerprint can be used for the identification of Os Draconis except joints.

*通信作者：陳科力（1947—），男，教授，博士生導師，研究方向為中藥資源及其品質。E-mai1：ke1ichen@126.com

作者簡介：崔曉慧（1979—），女，博士生，講師，研究方向為中藥資源及其品質。Te1：18971089410，E-mai1：53879185@qq.com

基金項目：武漢市2012年高新技術產業發展行動計劃生物技術與新醫藥專項（201260523193）

收稿日期：2015-07-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.031

中圖分類號：I282.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0624-06