基于毛細管電泳的鹿鞭D(zhuǎn)NA指紋鑒定方法

苑廣信， 李梓僮， 張麗華， 盛 瑜， 李洪宇， 李 坦， 孫 新， 李明成（.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林303；.北華大學(xué)生命科學(xué)中心，吉林吉林303；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，吉林吉林303）

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基于毛細管電泳的鹿鞭D(zhuǎn)NA指紋鑒定方法

苑廣信1， 李梓僮1， 張麗華1， 盛 瑜1， 李洪宇1， 李 坦2， 孫 新2， 李明成3*
（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013；2.北華大學(xué)生命科學(xué)中心，吉林吉林132013；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，吉林吉林132013）

摘要：目的 研究基于毛細管電泳的鹿鞭D(zhuǎn)NA指紋鑒定方法。方法 鹽析法提取梅花鹿鞭、馬鹿鞭、馴鹿鞭和赤鹿鞭的線粒體DNA，對序列為GAGCGTCGAA的引物進行IAPD擴增，毛細管電泳法分析其產(chǎn)物，再對所得指紋圖譜的相似度進行分析。結(jié)果 梅花鹿鞭指紋圖譜中有9個共有峰，馬鹿鞭指紋圖譜中有21個共有峰，與馴鹿鞭和赤鹿鞭有明顯差異。而且，其相似度均小于0.7。結(jié)論 該方法客觀、準(zhǔn)確、方便，可有效區(qū)分梅花鹿鞭、馬鹿鞭及其偽品（馴鹿鞭、赤鹿鞭）。

關(guān)鍵詞：鹿鞭；DNA指紋；毛細管電泳

KEY W 0RDS：Penis et Testis Cervi；DNA fingerprints；capi11ary e1ectrophoresis

鹿鞭是我國的傳統(tǒng)名貴中藥材，為鹿科動物梅花鹿（Gervus nippon Temminck）和馬鹿（Cervus elaphus Linnaeus）雄性的外生殖器［1］。中醫(yī)認(rèn)為，鹿鞭可以補腎精、壯腎陽，對于治療腰膝冷痛、陽痿早泄有顯著療效［2］。近年來，由于市場需求量大、貨緊價高等原因，各種偽品屢見不鮮，其中馴鹿（Rangifer tarandus）和赤鹿（Cervus canadensis）由于數(shù)量多、價格便宜，常被用于冒充正品鹿鞭出售。但鹿鞭成分復(fù)雜，而且市售品大多經(jīng)過加工、炮制，導(dǎo)致性狀和成分均有所改變，故傳統(tǒng)方法很難進行準(zhǔn)確鑒別。

DNA指紋法利用DNA在分子水平上，對物種進行鑒別，具有高度的種質(zhì)特異性，比傳統(tǒng)鑒定方法更科學(xué)和準(zhǔn)確［3-4］。其中，隨機擴增DNA多態(tài)性（IAPD）技術(shù)具有擴增結(jié)果多態(tài)性豐富、DNA用量少、無需專門設(shè)計引物等優(yōu)點，近年來在物種鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用［5］。另外，毛細管電泳具有快速、高效、樣品用量少、抗污染等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)、核酸、DNA、氨基酸等生物樣品分析中具有獨特優(yōu)勢［6-7］。本實驗將毛細管電泳和IAPD技術(shù)相結(jié)合，建立鹿鞭IAPD指紋鑒定方法，并采用相似度分析軟件對結(jié)果進行判定，旨在為鹿鞭的鑒定提供一種科學(xué)、準(zhǔn)確、客觀的新方法。

1 儀器與試藥

毛細管電泳儀（美國Agi1ent公司）；9700PCI擴增儀（美國ABI公司）；ST16I臺式低溫離心機（美國Thermo公司）；未涂層石英毛細管（75 μm×50 cm，40 cm，河北永年銳灃色譜器件有限公司）。

梅花鹿鞭1號、馬鹿鞭1號購自吉林市龍?zhí)渡铰箻I(yè)有限責(zé)任公司；梅花鹿鞭2號、馬鹿鞭2號購自蛟河市第一鹿場；梅花鹿鞭3號、馬鹿鞭3號購自吉林市藥材市場；馴鹿鞭1號、赤鹿鞭1號由吉林市食品藥品檢驗所提供；馴鹿鞭2號、赤鹿鞭2號由四平市食品藥品檢驗所提供。

DNA聚合酶、蛋白酶K、裂解液（含10 mmo1/L Tris-HC1［pH＝7.6］、10 mmo1/L Na2EDTA、50 mmo1/L NaC1）、2×Taq PCI Master Mix購自北京天根生化科技有限公司；DL-1000 DNA marker購自日本TaKaIa公司；四丁基磷酸銨（TBAP）購自美國Sigma公司；羥丙甲基纖維素（HPMC）和隨機引物購自上海生工生物有限公司。甲醇為色譜純；水為自制雙蒸水；其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 鹿鞭線粒體DNA提取 取鹿鞭樣品適量，洗凈、烘干、剪碎，于研缽中研成粉末，4℃下保存待用。鹽析法［8］提取鹿鞭線粒體DNA，取粉末0.1 g，置于離心管中，加裂解液0.5 mL、10% SDS 30 μL和蛋白酶K 15 μL，55℃水浴恒溫震蕩12 h，加飽和醋酸鈉溶液500 μL，繼續(xù)震蕩10 min，離心10 min（12 000 r/min），取上清液，加入等體積異丙醇，-20℃下靜置3 h，離心10 min（12 000 r/min），棄去上清液。沉淀加70%乙醇洗滌，離心10 min（12 000 r/min），棄去上清液，揮干乙醇，加滅菌蒸餾水100 μL溶解，即得DNA樣品溶液，-20℃下保存待用。

2.2 鹿鞭線粒體DNA瓊脂糖凝膠電泳 取DNA樣品溶液，按6∶1的比例加入6×1oading buffer，混勻，于0.8%瓊脂糖凝膠板（含0.5 μg/mL EB）上點樣，進行電泳。電壓60 V，電泳時間1 h，記錄紫外檢測結(jié)果。

2.3擴增引物的篩選 用合成的30條10-mer引物，分別對提取的鹿鞭線粒體DNA進行擴增，從中篩選出多態(tài)性豐富、擴增結(jié)果穩(wěn)定的引物，進行下一步研究。

2.4 IAPD擴增 PCI反應(yīng)體系總體積為25 μL，含2×Taq PCI Master Mix 12.5 μL、12.5 μmo1/L引物1 μL，模板DNA溶液2 μL和無菌蒸餾水9.5 μL。

PCI循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性5 min（94℃），變性80 s（94℃），退火1 min（36℃），延伸2 min （72℃），40個循環(huán)后再延伸10 min（72℃）。首循環(huán)變性3 min（95℃），PCI產(chǎn)物在4℃下保存待用。

2.5 毛細管電泳分析 參考文獻［9］，并進行優(yōu)化，緩沖液為0.8% HPMC-2 mmo1/L EDTA-15 mmo1/L TBAP-20 mmo1/L磷酸鹽緩沖液，Tris調(diào)節(jié)pH為7.3；分離電壓-8 kV；進樣電壓-10 kV；進樣時間15 s；檢測波長260 nm，記錄電泳圖譜。

新毛細管依次用甲醇、蒸餾水、1.0 mo1/L鹽酸、1.0 mo1/L NaOH溶液各沖洗15 min，0.1 mo1/L NaOH溶液沖洗30 min，再用蒸餾水和緩沖液各沖洗10 min，備用。每次進樣前，依次用0.1 mo1/L NaOH溶液、蒸餾水和緩沖液各沖洗2 min。2.6 數(shù)據(jù)分析 將所得的電泳圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）》軟件，進行相似度分析和鑒定。

3 實驗結(jié)果

3.1 線粒體DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜 由圖1可知，鹿鞭線粒體DNA條帶清晰完整，無明顯彌散和降解，相對分子量約為21 000 bp，表明采用“2.1”項下方法，可從鹿鞭干品中獲得完整、高純度的線粒體DNA，這為IAPD擴增的穩(wěn)定提供了一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 鹿鞭線粒體DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 M itochondrial DNA agarose gel electropherograms of Penis et Testis Cervi

3.2 擴增引物的篩選 通過逐步篩選，發(fā)現(xiàn)序列為GAGCGTCGAA的引物擴增結(jié)果重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、特異性強，故選擇該引物用于IAPD擴增。

3.3 IAPD擴增條件的優(yōu)化 退火溫度、模板DNA用量和引物用量是影響IAPD擴增的主要因素。

3.3.1 退火溫度 在33～38℃下，隨著退火溫度的升高，IAPD反應(yīng)的特異性增強，但溫度過高則會影響DNA鏈的聚合。實驗結(jié)果顯示，退火溫度36℃時，擴增效果最好。

3.3.2 模板DNA用量 在0.3～0.8 μg范圍內(nèi)，考察了模板DNA用量對擴增結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，模板DNA用量為0.5 μg時，擴增效果最好。3.3.3 引物用量 在0.5～2.0 μg范圍內(nèi)，考察了引物用量與擴增結(jié)果的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)引物用量越大，IAPD反應(yīng)越完全，但過大則會產(chǎn)生引物二聚體。結(jié)果顯示，當(dāng)引物用量為1 μg時，擴增效率最高，而且無引物二聚體產(chǎn)生。

3.4 方法學(xué)驗證

3.4.1 精密度試驗 取DL-1000 DNA marker適量，制成90 μg/mL溶液，在“2.5”項條件下連續(xù)測定6次。結(jié)果，各DNA片段電泳峰面積和遷移時間的ISD分別為2.9～5.6%和1.1～1.9%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性試驗 取梅花鹿鞭1號樣品適量，分成5份，分別按“2.1”和“2.4”項下方法提取DNA和IAPD擴增，然后在“2.5”項條件下測定。結(jié)果，各主要擴增片段電泳峰面積和遷移時間的ISD分別為2.7～5.9%和1.3～1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 基于毛細管電泳的鹿鞭IAPD指紋圖譜的構(gòu)建 取梅花鹿鞭1～3號和馬鹿鞭1～3號樣品適量，分別按“2.1”和“2.4”項下方法操作，然后在“2.5”項條件下測定，記錄電泳圖譜，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）》進行分析。結(jié)果，梅花鹿鞭指紋圖譜標(biāo)定了9個共有峰，相對保留時間的ISD＜0.45%，相似度在0.952～0.983之間；馬鹿鞭指紋圖譜標(biāo)定了21個共有峰，相對保留時間的ISD＜0.78%，相似度在0.945～0.969之間。具體見圖2。

3.6 鹿鞭樣品的鑒定 取馴鹿鞭和赤鹿鞭樣品適量，分別按“2.1”和“2.4”項下方法提取DNA 和IAPD擴增，然后在“2.5”項條件下測定。將所得的指紋圖譜與梅花鹿鞭、馬鹿鞭進行對比，計算相似度，結(jié)果見表1。由表可知，梅花鹿鞭、馬鹿鞭、馴鹿鞭和赤鹿鞭指紋圖譜具有明顯差異，相似度均小于0.7，說明該方法可用于梅花鹿鞭、馬鹿鞭及其偽品（馴鹿鞭和赤鹿鞭）的鑒定。

圖2 4種鹿鞭的電泳圖譜Fig.2 Electrophoretograms of four kinds of Penis et Testis Cervi

表1 4種鹿鞭指紋圖譜的相似度Tab.1 Sim ilarities of the fingerprints of four kinds of Penis et Testis Cervi

4 討論

隨機擴增DNA多態(tài)性（IAPD）分析技術(shù)與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，具有無需專門設(shè)計引物、多態(tài)性豐富、檢出率高、技術(shù)簡便、快速、易于程序化、樣品量少等優(yōu)點，因此被廣泛用于物種的鑒定和遺傳學(xué)研究［10-11］。但由于缺乏合適的檢測技術(shù)和鑒定方法，導(dǎo)致相關(guān)研究成果的應(yīng)用性不強。

毛細管電泳與IAPD技術(shù)聯(lián)用時，可發(fā)揮后者的優(yōu)勢并有效彌補其缺點：（1）毛細管電泳分辨率極高（可分離相差1 bp的DNA片段），兩者聯(lián)用可體現(xiàn)IAPD擴增產(chǎn)物的多態(tài)性，獲得多態(tài)性豐富的DNA指紋圖譜；（2）毛細管電泳靈敏度高，兩者聯(lián)用可檢測到IAPD擴增產(chǎn)物中含有量較低的片段，獲得信息量更大、更完整的DNA指紋圖譜；（3）毛細管電泳分析速度快，可明顯縮短IAPD擴增產(chǎn)物的分析時間，更適合大批量樣品的分析；（4）毛細管電泳分離IAPD擴增產(chǎn)物的同時，還可測定各擴增片段的濃度和分子量，獲得更豐富的信息，有利于建立更全面的指紋圖譜；（5）毛細管電泳可獲得數(shù)據(jù)形式的分析結(jié)果，然后導(dǎo)入軟件進行相似度分析。

本實驗建立了基于毛細管電泳的鹿鞭D(zhuǎn)NA指紋鑒別方法，實驗結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》分析時發(fā)現(xiàn)，梅花鹿鞭、馬鹿鞭、馴鹿鞭和赤鹿鞭指紋圖譜的相似度具有明顯差異，說明該方法可有效區(qū)分梅花鹿鞭、馬鹿鞭及其偽品（馴鹿鞭和赤鹿鞭），為該藥材的鑒定提供了一種客觀、準(zhǔn)確、方便的手段。

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DNA fingerprint identification of Penis et Testis Cervi based on capillary electrophoresis

YUAN Guang-xin1， LIZi-tong1， ZHANG Li-hua1， SHENG Yu1， LIHong-yu1， LI Tan2， SUN Xin2， LIMing-cheng3*

（I.College of Pharmacy，Beihua University，Jilin I32OI3，China；2.Life Scientific Research Center，Beihua University，Jilin I32OI3，China；3.Medical Inspection Institute，Beihua University，Jilin I32OI3，China）

ABSTRACT：AIM To study the DNA fingerprint identification of Penis et Testis Cervi based on capi11ary e1ectro-book=621,ebook=155phoresis.METH 0 DS Themitochondria1DNAs of Penis et Testis Cervi of Cervus nippon Temminck，Cervus elaphus Linnaeus，Rangifer tarandus and Cervus canadensis were extracted by sa1ting-out method.The primer （GAGCGTCGAA）was used for IAPD amp1ification，whose products were ana1yzed by capi11ary e1ectrophoresis. Then the simi1arities of obtained fingerprintswere ana1yzed.RESULTS Therewere nine and twenty-one common peaks in the fingerprints of Penis et Testis Cervi of C.nippon and C.elaphus，respective1y，having obvious difference from those of R.tarandus and C.canadensis.In addition，their simi1aritieswere 1ess than 0.7.C0NCLUSI0 N Thismethod is objective，accurate and simp1e，which can effective1y distinguish C.nippon and C.elaphus from their counterfeits（R.tarandus and C.canadensis）.

*通信作者：李明成（1964—），男，博士，教授，從事中藥DNA指紋圖譜研究。Te1：（0432）64608281，E-mai1：1imingcheng1964@ 163.com

作者簡介：苑廣信（1981—），男，博士，副教授，從事中藥質(zhì)量控制技術(shù)研究。Te1：（0432）64608281，E-mai1：yuanguangxin2007@ 163.com

基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目（吉教科合字［2012］143、［2014］212號）；吉林省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資助（2015Y077，2013G030，2013G019）

收稿日期：2015-08-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.030

中圖分類號：I282.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0620-05