熱分析技術和HPLC法研究荷葉炒炭工藝

馬俊楠， 孟祥龍， 薛非非， 張 欣， 李 坤， 王明芳， 張朔生（山西中醫學院，山西太原030619）

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熱分析技術和HPLC法研究荷葉炒炭工藝

馬俊楠， 孟祥龍， 薛非非， 張 欣， 李 坤， 王明芳， 張朔生*
（山西中醫學院，山西太原030619）

摘要：目的 采用熱分析技術和HPLC法，研究荷葉的炒炭工藝。方法 應用熱重-微商熱重（TG-DTG）技術，探討最佳炮制溫度。基于熱分析數據，采用HPLC法對不同炒炭工藝下荷葉中槲皮素的含有量進行測定。結果 最佳條件為荷葉10 g，投料溫度200℃，炮制溫度（280±10）℃，翻炒8 min，槲皮素含有量2.568 mg/g。結論 熱分析技術和HPLC法可應用于荷葉炒炭工藝。

關鍵詞：荷葉；炒炭；槲皮素；熱分析；HPLC

KEY W 0RDS：1otus 1eaves；carbonizing by stir-frying；quercetin；therma1ana1ysis；HPLC

熱分析技術［1］是在程序溫度（等速升溫、降溫、恒溫）控制下，測量溫度變化時物質物理變化的一類分析技術，主要包括熱重法（TG）、微商熱重法（DTG）、差熱分析法（DTA）、熱機械分析法（TMA）、動態熱機械分析法（DMA）等，被廣泛應用于建筑、化工、能源等各個領域，展現出良好的前景。近年來，學者將熱分析技術應用到中醫藥研究領域中，在中藥鑒定［2］、種類差異性［3］、藥效評價［4］以及中藥炮制［5］等各個方面都取得了較大的成效。本實驗將該技術引入荷葉的炒炭工藝研究中，對相關過程進行模擬，探討其炮制原理。

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發清陽、涼血止血功效，主治暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏［6］。荷葉炭為荷葉的加工炮制品，使用歷史悠久，始載于唐代《外臺秘要》中的“炙”，清代《得配本草》中明確指出，荷葉“活血生用，止血炒焦用”［7］。目前，各地對荷葉炭的炮制方法仍不統一，有炒炭和煅炭兩種，其炮制工藝也不規范，《中國藥典》、《全國中藥炮制規范》及各省市中藥炮制規范均未對荷葉炭的炮制時間和溫度作出明確規定，成品質量均憑經驗掌握，缺乏客觀的工藝參數，導致各地炮制品質量相差很大。因此，應通過系統研究，使荷葉飲片炮制工藝規范化、質量標準科學化。

1 儀器與材料

1.1 試藥 荷葉購自北京同仁堂大藥房，經張朔生教授鑒定為正品。槲皮苷（批號111538-200403）、槲皮素（批號100081-201408）、金絲桃苷（批號11521-200303）對照品（中國藥品生物制品檢定所）；異槲皮苷對照品（批號MUST-13072505，中國科學院成都生物研究所）。

1.2 試劑 AB-8大孔樹脂。甲醇為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 NETZSCH STA-409C多氣氛熱重-差熱-熱磁聯用儀（德國Netzsch公司）；IE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；AI 223CN分析天平（美國奧豪斯公司）；Agi1ent 1260高效液相色譜儀（美國Agi1ent公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；紅外測溫儀（深圳市歐普士電子技術有限公司）。

2 方法

2.1 熱分析實驗方法

2.1.1 荷葉樣品制備 稱取荷葉藥材50 g，粉碎，過80目篩，備用。

2.1.2 荷葉浸出物樣品制備［8］參照2010版《中國藥典》，精密稱取“2.1.1”項下荷葉粉末3 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h，回流1 h，冷卻，密塞，再稱定重量，70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。蒸干溶劑，55℃下烘干，研碎，過80目篩，即得。

2.1.3 荷葉黃酮提取物樣品制備［9］稱取荷葉粉末10 g，70%乙醇提取3次（荷葉提取液調pH至13），溶劑用量分別為8、6、6倍，提取時間為60、60、30 min，合并濾液，減壓回收溶劑。濃縮液過AB-8大孔樹脂柱，荷葉上樣量為35 mg/mL，5倍量50%乙醇洗脫，體積流量2 mL/min。減壓濃縮洗脫液，蒸干，55℃下烘干，研碎，過80目篩，即得。

2.1.4 荷葉生物堿提取物樣品制備［10］取荷葉10 g，用含0.1%鹽酸的70%乙醇浸泡提取36 h，共3次，中和，濃縮。再以乙酸乙酯為溶媒，索氏提取

1.5 h，再以pH＝1的酸水及氯仿依次萃取，萃取液減壓回收溶劑，蒸干，55℃下烘干，研碎，過80目篩，即得。

2.1.5 熱重試驗 以模擬空氣（N2∶O2＝4∶1）為載氣，體積流量為60 mL/min；升溫速率為5℃/min。分別取生荷葉藥材粉末、荷葉醇浸出物、荷葉總黃酮提取物、荷葉總生物堿提取物、槲皮素對照品、槲皮苷對照品、異槲皮苷對照品、金絲桃苷對照品（30±5）mg，置于坩堝中，從室溫升至600℃。

2.1.6 數據處理 所有熱解特性曲線、HPLC標準曲線等均使用Origin8.0繪制。

2.2 槲皮素含有量測定方法

2.2.1 荷葉炭樣品制備 取荷葉10 g，剪成指甲大小的碎片，用紅外測溫儀監控鍋溫至200℃投料，控制鍋底溫度為（260±10）℃，分別翻炒8、10、12 min，出鍋，攤開，放涼。同法炮制280、300、320℃下不同炒制時間的荷葉炒炭品。所得炮制品粉碎，過80目篩，編號（見表1），備用。

表1 樣品編號Tab.1 Sam ple codes

2.2.2 對照品供試液的制備 精密稱取槲皮素對照品6.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.063 7 mg/mL槲皮素對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取“2.2.1”項下12份樣品，每份0.5 g，置于平底燒瓶中，編號，加甲醇50 mL，連燒瓶稱重。70℃下加熱回流2.5 h，取出燒瓶，放冷，稱重，甲醇補足重量，抽濾。取續濾液10 mL，過微孔濾膜，即得。

2.2.4 色譜條件 Agi1ent SB-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸水（B），等度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長360 nm；進樣量10 μL。

2.2.5 標準曲線的制備 分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。在“2.2.4”項色譜條件下，測得槲皮素對照品的峰面積，以進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。

2.2.6 樣品含有量測定 精密稱取“2.2.1”項下荷葉炭樣品0.5 g，平行3份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.4”項色譜條件下進行測定。

3 結果

3.1 基于熱分析的荷葉的炮制工藝研究結果

3.1.1 基于荷葉藥材及其主要有效成分提取物熱解特性的最佳炮制溫度 見圖1、圖2、表2。

圖1 4種成分的TG-DTG曲線（5℃/m in）Fig.1 TG-DTG curves of four consituents（5℃/m in）

圖2 4種成分TG曲線、DTG曲線的比較Fig.2 Comparisons of TG curves and DTG curves of four consituents

由表可知，荷葉的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至132℃，熱失重率4.59%；揮發分釋放階段兩處熱失重速率峰峰溫分別為160、295℃，熱失重率分別為1.88%、59.18%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為455℃，熱失重率為34.35%。醇浸出物的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至130℃，熱失重率為3.89%；揮發分釋放階段熱失重速率峰峰溫為190℃，熱失重率為43.15%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為480℃，熱失重率為52.96%。總生物堿的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至120℃，熱失重率為2.72%；揮發分釋放階段兩處熱失重速率峰峰溫分別為275、417℃，熱失重率分別為67.32%、3.95%；難揮發分及固定碳燃燒階段為熱失重速率峰峰溫為508℃，熱失重率為26.01%。總黃酮的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至130℃，熱失重率為4.30%；揮發分釋放階段兩處熱失重速率峰峰溫分別為255、371℃，熱失重率均為28.56%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為552℃，熱失重率為35.64%。

表2 4種成分的熱解特性參數Tab.2 Parameters of pyrolysis characteristics of four consituents

荷葉中主要含有生物堿、黃酮、有機酸、揮發油等化學成分，其中生物堿大多屬于阿撲啡類，其熔點從102到245℃不等，骨架類型較多，結構差異頗大，故總生物堿的TG-DTG熱解特性曲線120～395℃處熱失重速率峰為眾多生物堿類化合物熱失重速率峰的疊加，此溫度范圍內熱失重量為67.32%，最大熱失重速率為2.52%/min；總黃酮的TG-DTG熱解特性曲線130～320℃處熱失重速率峰的熱失重為29.24%，最大熱失重速率為1.47%/min。從熱失重數據上看，荷葉藥材在180～370℃的揮發分釋放階段總生物堿熱失重速率及熱失重量均遠大于總黃酮，故未發生熱分解的黃酮類化合物為荷葉炭的主要藥效成分。為使荷葉主要藥效成分得到最大限度保留，并遵循炒炭存性原則，選擇總黃酮的TG-DTG熱解特性曲線揮發分釋放第二階段的分解速率峰作為目標峰，其起始溫度320℃為荷葉炒炭炮制的上限溫度。

3.1.2 基于黃酮類化合物熱解特性的荷葉最佳炮制溫度 見圖3、圖4、表3。

圖3 4種成分的TG-DTG曲線（5℃/m in）Fig.3 TG-DTG curves of four consituents（5℃/m in）

圖4 4種成分TG曲線、DTG曲線的比較Fig.4 Comparisons of TG curves and DTG curves of four consituents

表3 4種成分的熱解特性參數Tab.3 Parameters of pyrolysis characteristics of four consituents

國內外學者從荷葉中分離鑒定了13個黃酮類化合物，分別是nympho1ide A、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷、異鼠李素、金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷等［11］。本實驗選擇異槲皮苷、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素4種化合物進行熱解特性研究，以標定荷葉總黃酮提取物各階段熱失重速率峰，而且以上3種黃酮苷化合物的苷元均為槲皮素，與槲皮素熱解特性進行對比。

由圖3可知，異槲皮苷的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至200℃，此溫度區間熱失重率5.27%；揮發分釋放階段為熱失重速率峰峰溫為280℃，此溫度區間熱失重率分別為18.33%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為500℃，此溫度區間熱失重率為72.44%。金絲桃苷的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至190℃，此溫度區間熱失重率4.43%；揮發分釋放階段熱失重速率峰峰溫為265℃，此溫度區間熱失重率分別為19.52%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為490℃，此溫度區間熱失重率為55.39%。槲皮苷的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至180℃，此溫度區間熱失重率4.43%；揮發分釋放階段熱失重速率峰峰溫為250℃，此溫度區間熱失重率分別為16.14%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為485℃，此溫度區間熱失重率為77.57%。槲皮素的TG-DTG熱解特性曲線脫水階段為室溫至220℃，此溫度區間熱失重率8.99%；揮發分釋放階段熱失重速率峰峰溫為327℃，此溫度區間熱失重率分別為17.43%；難揮發分及固定碳燃燒階段熱失重速率峰峰溫為465℃，此溫度區間熱失重率為79.34%。

由圖4可知，4種成分于模擬空氣氣氛、5℃/min升溫速率條件下，熱穩定性依次為槲皮素＞異槲皮苷＞金絲桃苷＞槲皮苷。將其熱分解TG-DTG曲線與LF熱分解TG-DTG曲線進行比較可知，LF熱解TG-DTG曲線揮發分釋放階段峰溫255℃處熱失重速率峰為荷葉中黃酮苷的熱分解所產生，而371℃處為荷葉中槲皮素等黃酮化合物熱分解所產生。異槲皮苷熱解TG-DTG曲線揮發分釋放階段峰溫為280℃，此溫度下槲皮素剛進入揮發分釋放的主要熱分解階段。因此，280℃應為荷葉炒炭炮制的最佳溫度。

3.2 基于HPLC槲皮素含有量測定的荷葉炭炒炙工藝

3.2.1 標準曲線的制備 槲皮素回歸方程為y＝36.317χ-46.344，r＝0.999 4（n＝6），表明其在1.274～40.768 μg/mL范圍內線性關系良好，見圖5。

圖5 槲皮素標準曲線Fig.5 Standard curve of quercetin

3.2.2 精密度試驗 取“2.2.3”項下同一供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.2.4”項色譜條件下測定，連續進樣6次。結果，峰面積分別為974.5、922.5、946.8、951.8、947.6、937.2，ISD為1.81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

3.2.3 穩定性試驗 取“2.2.3”項下同一供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾后，分別于0、2、4、6、8、12 h在“2.2.4”項色譜條件下進行測定。結果，峰面積分別為1 042.3、1 089、1 125、1 127.7、1 127.3、1 122.4，ISD為3.10%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

3.2.4 重復性試驗 取“2.2.1”項下2號樣品0.5 g，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.2.4”項色譜條件下進行測定。結果，峰面積分別為933.2、912.5、942.4、949.1、915.2、1 021.8，代入回歸方程，求得6份樣品中槲皮素含有量分別為2.697、2.640、2.723、2.741、2.648、2.941 mg/g，平均值為2.731 mg/g，ISD為4.03%（n＝6），表明該方法重復性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取“2.2.1”項下2號樣品6份，每份0.25 g，分別加入0.063 7 mg/mL槲皮素對照品10 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.2.4”項色譜條件下進行測定，記錄槲皮素峰面積，計算其回收率，結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests（n＝6）

3.2.6 樣品含有量測定結果 槲皮素對照品與荷葉炭炮制品的HPLC色譜圖見圖6，各荷葉炭炮制品中槲皮素含有量見表5，可知LC2樣品槲皮素含有量最高，為3.091 mg/g，LC4次之，為2.568 mg/g。然后，對12份荷葉炭炮制品中槲皮素含有量的變化趨勢作圖，見圖7。

圖6 HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram s

表5 不同炮制品中槲皮素的平均含有量（n＝3）Tab.5 Average contents of quercetin in different processing products（n＝3）

3.2.7 LC2與LC4外觀形態對比 見圖8。

圖7 槲皮素的變化趨勢Fig.7 Change trend of quercetin

圖8 LC2、LC4的形態Fig.8 Shapes of LC2 and LC4

中藥炒炭需炒至藥物表面焦黑色或焦褐色，并遵循炒炭存性的原則，藥物炒炭時只能使其部分炭化，葉類藥材炒炭后仍可清晰辨別藥物原型。由圖可知，LC2荷葉炭樣品的外觀顏色并未達到焦褐色，而LC4炒炭要求。因此，LC4為合格的荷葉炭炮制品。

4 結論

基于對荷葉藥材、醇浸出物、總生物堿及總黃酮提取物的熱解TG-DTG曲線研究可知，320℃為荷葉炒炭的上限溫度。槲皮素等黃酮類成分為荷葉炭的主要藥效物質，根據其中槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷及槲皮素的TG-DTG熱解曲線可知，荷葉的最佳炒炭溫度為280℃。

HPLC法測得槲皮素的回歸方程為y＝36.317χ-46.344（r＝0.999 4），于1.274～40.768 μg/mL范圍內線性關系良好；實驗所用儀器精密度良好，ISD為1.82%；實驗樣品在12 h內穩定性良好，ISD為3.10%；實驗方法重復性良好，ISD為4.03%；實驗加樣回收率為95.17～104.72%，ISD為4.86%，表明該方法對荷葉炭中槲皮素的含有量測定具有可行性。另外，編號為LC2的荷葉炭樣品中槲皮素含有量最高，而LC4次之。

綜合荷葉炭中槲皮素含有量及外觀形態兩種因素，得出LC4樣品的制備工藝為取荷葉飲片10 g，剪成指甲大小的碎片，鍋溫升至200℃投料，控制鍋底溫度為（280±10）℃，翻炒8 min，這也是荷葉炭的最佳炮制工藝。

5 討論

荷葉中的生物堿和黃酮具有明顯的生物活性和生理功能［11］，目前關于該藥材炮制機理研究主要涉及的藥效部位也為這兩大類物質。劉洋等［12］比較荷葉生、炭飲片中總黃酮與總生物堿對兔體外凝血功能的影響，發現黃酮類成分為止血活性物質，并且槲皮素的作用強于金絲桃苷和異槲皮苷。王莉［13］等采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法，分析荷葉炮制前后生物堿成分的變化，發現荷葉制炭后，荷葉堿、N-降荷葉堿、番荔枝堿、甲基蓮心堿消失，另外有6種生物堿的色譜峰面積顯著降低。根據前期研究，本實驗對荷葉中這兩種成分進行提取分離，并借助熱分析技術對目標化合物于荷葉炒炭中的熱分解過程進行解析，為相關炮制工藝及原理的研究提供科學依據。

中藥炮制的現代研究是伴隨現代儀器分析技術及藥理毒理學的發展而發展的，鑒于中藥炮制“火力-溫度”與“火候-時間”的相關性，就溫度及時間的控制問題，其他學科可提供較好的借鑒，而且已發展成較為成熟的熱分析技術。這一現代化手段可用以量化中藥炮制的溫度和時間，闡明有關物質的轉變過程，為揭示其科學內涵奠定基礎，并具有創新性。

本實驗首次將熱分析技術引入荷葉的炒炭炮制工藝及原理研究中，使其更加客觀化、具體化、數字化，并將研究成果應用于實際中，探索熱分析模型的實踐性，證實熱分析技術應用于荷葉，甚至整個中藥炮制領域的可行性。本實驗將為該技術用于中藥炮制專業領域更深層、更細致的研究奠定基礎。

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Carbonizing processing by stir-frying of lotus leaves by thermal analysis and HPLC

MA Jun-nan， MENG Xiang-1ong， XUE Fei-fei， ZHANG Xin， LI Kun， WANG Ming-fang，ZHANG Shuo-sheng*

（Shanχi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan O3O6I9，China）

ABSTRACT：AIM To study the carbonizing processing by stir-frying of 1otus 1eaves by therma1 ana1ysis and HPLC.METH0DS The best processing temperature was investigated by thermogravimetric-derivative thermogravimetric（TG-DTG）.On the basis of therma1ana1ysis data，the contentof quercetin in 1otus 1eaves under different carbonizing processings by stir-fryingwas determined by HPLC.RESULTS The best conditionswere 10 g 1otus 1eaves，200℃for feeding temperature，（280±10）℃for processing temperature，and frying for 8 min.The content of quercetin reached 2.568 mg/g.C0NCLUSI0N Therma1ana1ysis and HPLC can be used for carbonizing 1otus 1eaves by stir-frying.

*通信作者：張朔生（1965—），男，教授，碩士生導師，從事中藥飲片炮制工藝及質量標準研究。E-mai1：zhangshuosheng@ a1iyun.com

作者簡介：馬俊楠，女，碩士，從事中藥飲片炮制工藝研究。E-mai1：531839240@qq.com

基金項目：山西省中藥現代化關鍵技術研究振東專項（2014ZD0302）

收稿日期：2015-10-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.029

中圖分類號：I 284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0613-08