反向分子對接法預測龍須藤兩種多甲氧基黃酮的分子靶標

吳曉敏， 周毅生， 楊俊騰， 莫海珊（廣東藥學院，廣東廣州510006）

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反向分子對接法預測龍須藤兩種多甲氧基黃酮的分子靶標

吳曉敏， 周毅生*， 楊俊騰， 莫海珊
（廣東藥學院，廣東廣州510006）

摘要：目的 預測龍須藤兩種多甲氧基黃酮5，7，3＇，4＇，5＇-五甲氧基黃酮（PMFA）及5，6，7，5＇-四甲氧基-3＇，4＇-亞甲二氧基黃酮（TMFA）的分子靶標。方法 采用反向分子對接法，對這兩種成分進行分析。結果 PMFA和TMFA可能在抗癌、抗類風濕性關節炎及抗心血管疾病等方面發揮作用，并通過防止CTSK與DHODH靶點作用于To11樣受體、破骨細胞分化與嘧啶代謝等途徑治療類風濕性關節炎。結論 該方法可為龍須藤及兩種多甲氧基黃酮的藥效學及分子作用機制實驗提供參考。

關鍵詞：龍須藤；PMFA；TMFA；分子靶標；反向分子對接

KEYW 0RDS：Bauhinia championii（benth.）Benth.；PMFA；TMFA；mo1ecu1e targets；inversemo1ecu1e docking

龍須藤為豆科蘇木亞科羊蹄甲屬植物龍須藤Bauhinia championii（benth.）Benth.的干燥藤莖，是一味畬醫病證論治中針對痹癥，治療類風濕性關節炎（IA）的特色藥［1-2］，其活性成分很多，但目前相關研究主要集中于其不同有機溶劑提取物的藥理作用上，而對其有效單體成分及其抗類風濕性關節炎分子機制的研究較少。5，7，3＇，4＇，5＇-五甲氧基黃酮（PMFA）及5，6，7， 5＇-四甲氧基-3＇，4＇-亞甲二氧基黃酮（TMFA）為龍須藤兩種活性成分［3］，具有抗炎活性［3-6］，但迄今國內對兩者的相關藥理研究仍較少，其抗炎機制也不明確。在藥物的開發研究過程中，為彌補傳統藥物研發手段的盲目性及高成本，以計算機為工具進行理論模擬、計算和預測，為藥物開發提供理論指導信息的計算機輔助藥物設計技術（CADD）越來越受到重視［7-8］。其中，以小分子化合物（天然產物、先導化合物及化學合成物）為探針，在已知結構的靶點數據庫內搜尋可能與之結合的生物大分子，并通過空間和能量匹配相互識別形成分子復合物，從而預測藥物潛在作用靶點的反向分子對接技術，在探索小分子的藥理作用及機制等方面得到廣泛的認可［9］。因此，本實驗以龍須藤兩種多甲氧基黃酮PMFA及TMFA為研究對象，利用反向分子對接法對其潛在作用靶標進行虛擬篩選和分析，一方面可為兩者潛在的藥理作用提供參考，而另一方面可為龍須藤的藥理作用機制研究起到指導作用。

1 材料與方法

在Mo1inspiration網站（http：//www.mo1inspiration.com/）中畫出PMFA和TMFA的分子結構（圖1），計算出可以作為兩者吸收的預測參數，再根據藥物吸收五原則［10］評價其吸收性質。將PMFA 與TMFA小分子以3Dmo12文件提交給PharmMapperper server（http：//59.78.96.61/pharmmapper/he1p. php）進行優化，生成多種構象，選擇人類蛋白靶標庫，其他參數選為默認，對配體小分子與其數據庫中的藥效團自動匹配，并使其按匹配的z’-score打分高低排序［11］。將z’-score＞0的所有靶點作為分析對象，利用PDTD（http：//www.dddc.ac.cn/pdtd/ benchmark.php）、Drubank（http：//www.drugbank. ca/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd. asp）數據庫進行化合物-靶點-疾病分析歸類，利用京都基因與基因組百科全書（the Kyoto Encyc1opedia of Genes and Genomes，KEGG，http：//www.genome. jp/kegg/）通路數據庫進行通路注釋和分析。

圖1 PMFA和TMFA的結構式Fig.1 Structures of PMFA and TMFA

2 結果

2.1 PMFA與TMFA的吸收預測 Mo1inspiration網站對PMFA進行吸收性質預測，吸收參數為相對分子質量（MW）＝372.373、氫鍵給體（nOHNH）＝0、氫鍵受體（nON）＝8、脂水分配系數（miLogP）＝3.386；對TMFA進行吸收性質預測，吸收參數為相對分子質量（MW）＝388.372、氫鍵給體（nOHNH）＝0、氫鍵受體（nON）＝7、水分配系數（miLogP）＝2.665。結果，兩者均符合五原則中氫鍵給體、受體、相對分子質量和脂水分配系數等參數的要求，表明具有良好的口服吸收性質與類藥性。

2.2 PMFA與TMFA潛在靶標的反向預測 根據配體反向分子對接PharmMapper數據庫篩選結果（PMFA的Job ID為141123183037，TMFA的JobID為141123183306），預測PMFA有PDB ID編號不同89個（相同蛋白名稱為61個）、TMFA有95個（64個）有統計學意義的潛在分子靶點（i.e.z’-score＞0）。得分最高的前10個蛋白見表1。

通過對61個PMFA與64個TMFA實際靶點作進一步分析發現，由于靶點所涉及的疾病較多，故主要以龍須藤主治疾病進行分類，兩者與類風濕性關節炎相關的靶點均有2個，而且蛋白名稱一致（CTSK、DHODH）；與心血管疾病相關的靶點PMFA有9個、TMFA有8個（圖2）。同時，對靶點整體分析發現，PMFA與癌癥相關的預測靶點有20個、TMFA有24個（圖3）。

圖2 PMFA和TMFA與心血管疾病相關靶點Fig.2 Targets related With cardiovascular diseases of PMFA and TMFA

通過人工檢索文獻發現，目前國內未發現PMFA和TMFA在心血管及癌癥方面的報道，但有在炎癥方面的研究［3-6］，因此兩者作為龍須藤活性成分，在抗類風濕性關節炎方面的可能性較大，故選擇相應2個靶點CTSK（PMFA的Iank為20、83，TMFA為41）、DHODH（PMFA為62，TMFA為71）作進一步分析，PharmMapper提供配體與兩靶蛋白藥效團的匹配信息見圖4。PMFA與CTSK （Iank為20，PDB為1BGO）藥效團模型中含有4個疏水性特征、1個氫鍵供體、4個氫鍵受體（圖4a）；與CTSK（Iank為83，PDB為1TU6）藥效團模型中含有3個疏水性特征、2個氫鍵供體、4個氫鍵受體（圖4b）；與DHODH（Iank為62，PDB為2FPY）藥效團模型中含有6個疏水性特征、1個負電荷中心、2個氫鍵受體（圖4c）。TMFA與CTSK（Iank為41，PDB為1BGO）藥效團模型中含有4個疏水性特征、1個氫鍵供體、4個氫鍵受體（圖4d）；與DHODH（Iank為1，PDB 為2FPY）藥效團模型中含有6個疏水性特征、1個負電荷中心、2個氫鍵受體（圖4e）。利用KEGG對兩靶點進行通路分析，發現其可能通過to11樣受體信號通路、破骨細胞分化通路及嘧啶代謝通路發揮抗類風濕性關節炎作用，見圖5。

表1 得分最高的前10個蛋白Tab.1 Top 10 proteinsWith the highest scores

圖3 PMFA和TMFA抗癌靶點Fig.3 Anticancer targets of PMFA and TMFA

圖4 PMFA、TMFA相互影響與其抗類風濕性關節炎靶蛋白藥效模型Fig.4 Pharmacophoremodels of the interactions of PMFA and TM FA and their anti-rheumatoid arthritis target proteins

3 討論

本實驗主要利用Mo1inspiration、PharmMapper、KEGG等生物學信息手段，對龍須藤活性多甲氧基黃酮類化合物PMFA與TMFA進行吸收、靶點及作用通路的預測分析，結果表明兩者可能被吸收，并通過防止組織蛋白酶K與二氫乳清酸脫氫酶作用于To11樣受體、破骨細胞分化及嘧啶代謝等途徑，用以發揮抗類風濕性關節炎的作用，這為龍須藤治療該疾病的分子機制提供了理論依據。在所有統計學有意義的靶點中發現，治療中風、高血壓、心肌缺血等心血管疾病有9個相關潛在靶點，其中有8個為兩配體共有，其可作為深入探討龍須藤行氣活血，以治療中風偏癱的分子機制線索。

圖5 PMFA和TMFA抗類風濕性關節炎靶點及相關通路Fig.5 Anti-rheumatoid arthritis targets and related path-Ways of PMFA and TMFA

更值得關注的是，PMFA篩選的61個靶點中有20個與癌癥相關，而64個TMFA靶點中有24個，兩者共有17個，而且在PharmMapper相應藥效團模型的分值均靠前，其中得分前五名，并與癌癥相關的靶點為細胞周期依賴性蛋白激酶6 （CDK6）與蛋白激酶2（CDK2），其在兩種多甲氧基黃酮中的篩選結果排名一致，分別為Iank1與Iank5。在人體細胞中，CDK6主要控制細胞循環G1期，而CDK2則主要控制細胞循環G1、G2、S期［12］，兩者均與細胞增殖凋亡等功能息息相關。細胞周期依賴性蛋白激酶家族（CDKs）與相應的周期蛋白結合，調控細胞周期的進程，在真核細胞周期的各種檢驗點中扮演著重要角色，被認為是潛在的抗癌因子［13］。根據反向分子對接結果，提示PMFA、TMFA和龍須藤可能與抗癌相關，故可在后期藥理實驗中研究其治療癌癥的可能性。

然而，雖然CADD因其在提高藥物研發成功率、降低研發成本、縮短研發周期等方面的優勢而成為目前創新藥物研究的核心技術之一［14］，但計算數據始終不能替代藥理實驗數據。本實驗主要是為藥物開發提供理論參考，并為后續分子機制研究指導方向，故最終還需要傳統藥理藥效學實驗進行驗證。

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［飲片炮制］

Forecast of molecule targets of tWo polymethoxylated flavonoids of Bauhinia championii by inversemolecule docking

WU Xiao-min， ZHOU Yi-sheng*， YANG Jun-teng， MO Hai-shan

（Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 5IOOO6，China）

ABSTRACT：AIM To forecast themo1ecu1e targets of two po1ymethoxy1ated f1avonoids（5，7，3＇，4＇，5＇-pentamethoxyf1avone［PMFA］and 5，6，7，5＇-tetramethoxy-3＇，4＇-methy1endioxyf1avone［TMFA］）of Bauhinia championii（benth.）Benth..METH 0DS These two constituents were ana1yzed by inversemo1ecu1e docking. RESULTS PMFA and TMFA might p1ay an important ro1e in resisting cancers，rheumatoid arthritis and cardiovascu1ar diseases，which treated rheumatoid arthritis through preventing CTSK and DHODH from acting on to11-1ike receptor，osteoc1ast differentiation and pyrimidine metabo1ism pathways.C0 NCLUSI0N Thismethod can provide a reference for the pharmacodynamics and mo1ecu1armechanisms of action of two po1ymethoxy1ated f1avonoids and Bauhinia championii.

*通信作者：周毅生（1957—），男，教授，碩士生導師，從事藥物新劑型與新技術的研究。Te1：（020）39352168，E-mai1：yishzhou @a1iyun.com

作者簡介：吳曉敏（1992—），女，碩士，從事中藥制劑研究與開發。Te1：13416191628，E-mai1：wuxiaomin0314@126.com

收稿日期：2015-05-12

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.027

中圖分類號：I284.3

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0603-04