10種含梔子中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的同時測定

張小琴， 湯晟凌， 呂偉旗（溫州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院，麗水市人民醫(yī)院藥劑科，浙江麗水323000）

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10種含梔子中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的同時測定

張小琴， 湯晟凌*， 呂偉旗
（溫州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院，麗水市人民醫(yī)院藥劑科，浙江麗水323000）

摘要：目的 采用HPLC法與一測多評法，同時測定10種含梔子中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量。方法

制劑分析采用Ag1ient1200色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測波長238 nm（0～20 min）、440 nm（20～30 min）；柱溫30℃。結果 HPLC圖譜的峰形及分離度良好。以梔子苷為內標物，西紅花苷-Ⅰ的相對校正因子為1.085（ISD＝0.73%），其重現(xiàn)性不受色譜柱影響。結論 除清火梔麥片與小兒清熱片外，其余8種含梔子中藥制劑中梔子苷的含有量均符合藥典標準。

關鍵詞：中藥制劑；梔子；梔子苷；西紅花苷-Ⅰ；HPLC；一測多評

KEY W 0RDS：traditiona1Chinesemedicina1 preparations；Gardenia Jasminoides；geniposide；crocin-I；HPLC；quantitative ana1ysis ofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）

梔子是茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides E1-1is的干燥成熟果實，性寒，味苦，歸心、肺、三焦，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等功效［1］，是常用的大宗藥材品種之一，臨床用于熱病心煩、黃疸尿赤、目赤腫痛、火毒瘡瘍等癥。目前，市售含梔子中藥制劑的種類繁多，其劑型包括散劑、片劑、丸劑、膠囊劑、注射水劑等，常見的有梔子金花丸、清火梔麥片、八正合劑、三子散、清開靈片等。

環(huán)烯醚萜苷及西紅花苷是梔子的主要有效成分，其中梔子苷是環(huán)烯醚萜類的主要化合物。現(xiàn)代藥理學研究表明，梔子苷具有保肝利膽、促進胰腺分泌、自由基損傷拮抗、保護神經細胞、抗菌消炎、降血糖與抗腫瘤等作用［2-5］，而西紅花苷具有降壓、改善冠心病心絞痛導致血流變異常、抗血栓、保護血管內皮細胞、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、清熱利膽退黃與抗氧化等作用［6-10］。《中國藥典》2010年版規(guī)定，含梔子中藥制劑多以梔子苷含有量為梔子的質量標準，但對西紅花苷暫無相關要求。由于西紅花苷-Ⅰ是西紅花苷類的主要化合物，而且活性顯著［11-12］，故本實驗選取市售10種含梔子的中藥制劑，建立同時測定其中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的HPLC法與一測多評法，考察《中國藥典》規(guī)定的梔子苷標準與西紅花苷-Ⅰ含有量，為含其質量標準評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料 Ag1ient1200高效液相色譜儀（美國Ag1ient公司）；KQ5200DE數控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；Mi11i-Q Academic超純水儀（美國Mi11ipore公司）；DGG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；FA1004B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

梔子苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號116816）；西紅花苷-Ⅰ對照品（純度＞97%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-12071108）。乙腈為色譜純（美國Tedia公司）；水為去離子水；其他試劑均為分析純。市售含梔子中藥制劑共10種，均為《中國藥典》2010年版收錄的成方制劑［1］，具體信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Ag1igent ec1ipse XDB-C18、Thermo Syncronis C18、Syncronis C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，1∶9；15 min，2∶8；30 min，3∶7）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長238 nm（0～20 min）、440 nm（20～30 min）；柱溫30℃；進樣量50 μL。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取梔子苷與西紅花苷-Ⅰ對照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成含0.208 mg/mL梔子苷與0.032 mg/mL西紅花苷-Ⅰ的混合標準品溶液，避光保存，備用。

1.2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取研磨至粉狀的固體樣品0.2 g（精密吸取液體樣品0.2 mL），置于50 mL錐形瓶中，加入75%甲醇溶液25 mL，25℃下超聲提取1 h，抽濾。吸取5 mL，75%甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.3 線性關系考察 精密吸取梔子苷標準品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，西紅花苷-Ⅰ標準品溶液0.1、0.3、0.6、1.2、2.4 mL，用75%甲醇定容至10 mL量瓶中，在“1.2.1”項色譜條件下測定。以梔子苷與西紅花苷-Ⅰ標準品溶液的質量濃度為縱坐標（Y），峰面積為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算出兩者的線性范圍分別為5.20～83.2 μg/mL和0.32～7.68 μg/mL，回歸方程以及相關系數分別為Y＝336.85X-290.77，R2＝0.999 0；Y＝149.76X-89.5，R2＝0.999 2。1.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一清開靈片樣品，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，置于以下條件保存。（1）高溫度試驗：40℃，避光；（2）高濕度試驗：室溫，相對濕度（90±5）%，避光；（3）強光照射試驗：室溫，（5 000±500）Lux光照強度下照射。分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣，在“1.2.1”項色譜條件下測定相應峰面積，計算出以上條件下梔子苷與西紅花苷-Ⅰ峰面積的ISD值（n＝8）分別為0.89%、1.83%；1.21%、2.08%；10.89%、15.08%。結果表明，供試品溶液在高濕度與40℃避光條件下24 h內穩(wěn)定，而在強光照射條件下不穩(wěn)定，故本實驗樣品均在室溫24 h內避光條件下測定含有量。

表1 制劑基本信息Tab.1 Basic information of the preparations

1.2.5 精密度試驗 取梔子苷標準品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得梔子苷峰面積ISD值為1.99%，西紅花苷-Ⅰ峰面積ISD值為2.08%，表明儀器精密度良好。

1.2.6 重復性試驗 取同一清開靈片樣品6份，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下測定梔子苷與西紅花苷-Ⅰ含有量，得前者平均含有量為0.368%，ISD值為2.35%，后者平均含有量為0.023 1%，ISD值為0.58%，表明該方法重復性良好。

1.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的三子散適量，精密加入梔子苷與西紅花苷-Ⅰ對照品，配制成供試品溶液進行測定，計算公式為加樣回收率＝（H3-H1）/H2×100%（H1為樣品中被測成分的含有量，H2為加入對照品的含有量，H3為實際測得含有量）。結果，梔子苷實際測得質量濃度在11.98～12.08 μg/mL之間，而西紅花苷-Ⅰ在1.267～1.299 μg/mL之間，均在各自線性范圍內。同時，前者平均回收率為99.41%，ISD值為0.86%（n＝6），而后者平均回收率為100.01%，ISD值為0.76%（n＝6），具體見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n＝6）

1.2.8 樣品含有量測定 精密稱取研磨至粉狀的固體樣品0.2 g（精密吸取液體樣品0.2 mL），置于50 mL帶塞錐形瓶中，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下，對10種中藥制劑樣品中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量進行測定，重復3次。

1.2.9 相對校正因子的測定 以梔子苷為內標物，測定西紅花苷-Ⅰ的相對校正因子，計算公式為fks＝（Wk×A＇s）/（Ws×A＇k）［13-14］（W為進樣量，A＇為峰面積，s為梔子苷，k為西紅花苷-Ⅰ）。結果，西紅花苷-Ⅰ的平均校正因子為1.085，ISD值為0.73%，詳見表3。

表3 西紅花苷-Ⅰ的相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of crocin-I

2 結果與分析

2.1 中藥制劑中梔子苷與西紅苷-I含有量的HPLC法優(yōu)化 在文獻［12，15-16］的基礎上，對這兩種成分的提取方法進行優(yōu)化，分別考察了50%、75%、85%甲醇，40、60、80 min提取時間，20、25、30、35℃提取溫度下兩者的提取效率。結果顯示，市售中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ在75%甲醇、25℃的條件下，超聲提取1 h即可被完全提取，而且操作簡便，雜質少。此外，還考察了乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水流動相與梯度程序，發(fā)現(xiàn)兩者在乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）流動相下梯度洗脫（0 min，1∶9；15 min，2∶8；30 min，3∶7）時，出峰效果與分離度最好，具體見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 制劑中梔子苷含有量比較 10種含梔子的中藥制劑均為2010年版《中國藥典》收錄的成方制劑，其質量標準規(guī)定均包括梔子苷含有量。在本實驗優(yōu)化的HPLC方法下，10種中藥制劑中梔子苷的含有量存在差異，見表4。其中，以三子散為最高，達0.781%，而清開靈注射液最低，僅0.058%，平均0.278%。另外，除清火梔麥片與小兒清熱片藥典無商品規(guī)格，故無法等量換算梔子苷標準外，其余8種制劑中梔子苷含有量均達到藥典標準。

表4 制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量Tab.4 Contents of geniposide and crocin-I in the preparations

2.3 制劑中西紅花苷-Ⅰ含有量比較 10種中藥制劑中西紅花苷-Ⅰ的含有量存在差異，其中以三子散為最高，達0.063 8%，而清火梔麥片最低，僅0.004 2%，平均0.027 2%。為方便與本實驗結果比較，根據《中國藥典》2010年版規(guī)定的梔子苷標準，將其換算成百分含有量，換算公式為標準百分含有量＝梔子苷限度值/單位規(guī)格質量× 100%，具體見表4。

2.4 一測多評法與HPLC法結果比較 根據西紅花苷-Ⅰ的相對校對因子，用一測多評法測得供試樣品中西紅花苷-Ⅰ的含有量，見表4。由表可知，其平均含有量為0.026 8%，與HPLC法（0.027 2%）無顯著性差異（P＞0.05），表明一測多評法可用于中藥制劑中的多指標成分的質量評價，具有較好的可信度。

3 結論與討論

長期以來，中成藥的質量大多以單一指標進行控制，難以真正體現(xiàn)中藥的多效性和整體性。中藥多靶點的作用特點要求對其進行多成分質量控制，因此相關模式應運而生，但商品化對照品的供不應求和多指標控制高昂的檢測費用限制了其在實際生產、科研和監(jiān)管領域的應用，而一測多評法為解決該矛盾提供了新思路，但是中藥復方制劑的成分種類比單味中藥飲片更多、更復雜，其應用難度更大［17-20］。因此，檢測波長的確定、內參物的選擇、色譜峰的定位、校正因子的重現(xiàn)性等因素都影響著該方法的可靠性。

梔子苷與西紅花苷-Ⅰ是含梔子中藥制劑中的主要化學成分，由于兩者保留時間較近，故為本實驗一測多評法的建立提供了良好的應用基礎。在內標物的選擇上，由于梔子苷含有量相對較高，分離度與穩(wěn)定性較好，并且其標準品易得，價格低廉，而西紅花苷對照品價格昂貴，故選擇梔子苷為內標物。分別兩者色譜峰進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)前者的最大吸收波長為238 nm，而后者為440 nm，故選擇238 nm與440 nm為梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的檢測波長。當僅使用梔子苷對照品時，鑒于西紅花苷色譜峰與其色譜峰的保留時間較近，因此選用相對保留時間來定位目標色譜峰。分別用Agi1ent ec1ipse XDB-C18、Thermo Syncronis C18、Syncronis C183種色譜柱考察校正因子的重現(xiàn)性，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱對其影響較小（ISD＜3.0%），重復性較好，由于實驗條件所限，故未對不同色譜儀考察校正因子重復性，將在后續(xù)工作中予以補充。

同時，本實驗考察了甲醇濃度、提取時間、流動相等因素對含有量測定的影響。結果表明，梔子苷與西紅花苷-Ⅰ在75%甲醇、25℃條件下超聲提取1 h即可被完全提取，在乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）流動相下梯度洗脫（0 min，1∶9；15 min，2∶8；30 min，3∶7）時，出峰效果與分離度最好。而且，一測多評法與HPLC法的分析結果無明顯差異，均可用于同時測定這兩種成分的含有量，此外在西紅花苷標準品稀缺時，可優(yōu)先選用一測多評法。

2010年版《中國藥典》收錄的成方制劑中，含梔子的中藥制劑就有數十種之多，其中以梔子為主要成分，并規(guī)定梔子苷含有量標準的也有十余種，但均無西紅花苷標準。本實驗選取市售10種含梔子的中藥制劑，建立一測多評法與HPLC法同時測得其中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量，可為含該制劑的質量評價提供參考依據。同時，比較了10種制劑中這兩種成分的含有量，發(fā)現(xiàn)除清火梔麥片與小兒清熱片在2010年版《中國藥典》中無商品規(guī)格，無法等量換算梔子苷標準外，其余8種制劑梔子苷含有量均達到藥典標準。因此，建議2015年版《中國藥典》完善清火梔麥片與小兒清熱片的“商品規(guī)格“一欄，同時在含有量測定指標中考慮增加西紅花苷類成分。

參考文獻：

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］ 姚冬冬，舒 孌，楊 蕾，等.梔子及其活性成分梔子苷防治糖尿病作用機制研究進展［J］.中國中藥雜志，2014，39（8）：1368-1373.

［3］ 師永清，師永花.HPLC同時測定牛黃清胃丸中梔子苷和黃芩苷［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）：86-88.

［4］ 王志超，楊小龍，張 珂，等.梔子苷藥理作用的研究進展［J］.河南科技大學學報：醫(yī)學版，2012，30（2）：159-160.

［5］ 顏靜恩，李晚忱，呂秋軍，等.梔子苷的降糖作用和對PPAIγ受體的激活［J］.四川農業(yè)大學學報，2007，25 （4）：415-418.

［6］ 朱 波，施林妹，徐象華，等.不同遮蓋方式對番紅花生長發(fā)育的影響［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41（8）：232-233.

［7］ 劉 瑛，古天明，周 紅.西紅花苷類成分藥理作用研究概況［J］.成都大學學報：自然科學版，2008，27（1）：16-19.

［8］ 緒廣林，余書勤，龔祝南，等.西紅花苷對大鼠實驗性高脂血癥的影響及其機制研究［J］.中國中藥雜志，2005，30（5）：369-372.

［9］ 侯金燕，羅 琳，竇志華，等.HPLC-DAD測定茵陳蒿湯中兒茶素、綠原酸、西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（6）：48-51.

［10］ 張曉巖，喻 靜，張先鈞，等.西紅花苷-1對急性低氧條件下大鼠學習記憶及海馬SIIT1表達的影響［J］.中草藥，2013，44（10）：1314-1317.

［11］ 施林妹，徐象華，朱 波，等.西紅花主要活性成分含量變異規(guī)律［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（13）：113-116.

［12］ 羅光明，陳 巖，李 霞，等.不同居群品系梔子中梔子苷和西紅花苷-1含量的比較研究［J］.中藥材，2010，33 （9）：1376-1378.

［13］ 張 勇，張 玲，謝曉梅.一測多評法同時測定木瓜中2種常見三萜酸［J］.中成藥，2013，35（4）：770-773.

［14］ 劉 圓，魏惠珍，龔建平，等.一測多評法測定健脾丸中4種黃酮類成分［J］.中成藥，2015，37（5）：995-999.

［15］ 付建武，彭 紅，周玉春，等.高效液相色譜波長轉換法測定西紅花苷-1和梔子苷的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：2939-2940.

［16］ 石鳳鳴，王文君，陳 雛，等.梔子指紋圖譜及不同生長期西紅花苷和梔子苷含量的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（8）：1874-1876.

［17］ 馮偉紅，楊 菲，王智民，等.一測多評法與外標法測定雙黃連制劑中黃酮類成分含量的比較分析［J］.中國藥學雜志，2012，47（20）：1665-1669.

［18］ 高慧敏，宋宗華，王智民，等.適合中藥特點的質量評價模式—QAMS研究概述［J］.中國中藥雜志，2012，37 （4）：405-416.

［19］ 趙 倩，馮偉紅，張啟偉，等.“一測多評”法用于梔子金花丸多成分含量測定的可行性研究［J］.中國中藥雜志，2014，39（10）：1826-1833.

［20］ 劉志輝，顧 瑋，常星潔，等.“一測多評”法測定麥貞花顆粒中不同類型成分的含有量［J］.中成藥，2012，34 （12）：2342-2347.

Simultaneous determ ination of geniposide and crocin-I in ten traditional Chinese medicinal preparations containing Gardenia jasm inoides

ZHANG Xiao-qin， TANG Cheng-1ing*， LVWei-qi

（The Siχth Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University；Department of Pharmacy，Lishui People’s Hospital，Lishui323OOO，China）

ABSTRACT：AIM To simu1taneous1y determine the contents of geniposide and crocin-I in ten traditiona1Chi-book=570,ebook=104nesemedicina1preparations containing Gardenia Jasminoides by HPLC and quantitative ana1ysis ofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）.METH0DS The ana1yses of preparations were conducted on Ag1ient 1200 co1umn，mobi1e phase was acetonitri1e-0.1% phosphorus acid in a gradient e1ution manner，detection wave1engths were set at238 nm（0 -20 min）and 440 nm（20 -30 min），and co1umn temperature wasmaintained at 30℃.RESULTS Manifesting good peaks and reso1utions of HPLC chromatograms，crocin-Idisp1ayed its re1ative correction factor of1.085（ISD＝0.73%）with geniposide as the interna1standard，whose reproducibi1itywas independentof co1umns.C0NCLUSI0N Except for Qinghuo Zhimai Tab1ets and Xiao’er Qingre Tab1ets，another eight traditiona1Chinesemedicina1preparations containing Gardenia Jasminoides accord with Chinese Pharmacopoeia criteria.

*通信作者：湯晟凌（1977—），女，副主任藥師，從事中藥新藥開發(fā)與臨床藥學研究。E-mai1：aurora0119@163.com

作者簡介：張小琴，女，主管藥師，從事醫(yī)院制劑與中成藥活性成分研究。E-mai1：1stracy1027@163.com

收稿日期：2015-09-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.019

中圖分類號：I 927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0569-06