UHPLC法同時測定六味香連膠囊中5種成分

羅晨煖， 羅躍華， 陳偉康， 鄭東昆， 黃惠明（1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330006；.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌33009）

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UHPLC法同時測定六味香連膠囊中5種成分

羅晨煖1，2， 羅躍華1，2， 陳偉康2， 鄭東昆1，2， 黃惠明1*
（1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330006；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌330029）

摘要：目的 建立超高效液相色譜（UHPLC）法同時測定六味香連膠囊（木香、鹽酸小檗堿、枳實等）中柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚的含有量。方法 該藥物70%甲醇提取物的分析采用Agi1ent XDB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；乙腈（A）-0.2%磷酸（B）為流動相，梯度洗脫；體積流量0.7 mL/min；檢測波長294 nm；進(jìn)樣體積1 μL；柱溫40℃。結(jié)果 柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚分別在3.78～189.20 μg/mL（r＝0.999 5）、1.28～64.00 μg/mL（r＝0.999 5）、26.78～1 339.20 μg/mL（r＝0.999 7）、1.48～74.00 μg/mL（r＝0.999 5）、1.33～66.60 μg/mL（r＝0.999 9）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率（n＝9）分別為98.8%、99.0%、99.6%、98.7、100.1%，ISD分別為1.7%、1.6%、1.4%、2.2%、1.6%。結(jié)論 該方法簡便快速，重復(fù)性好，可用于六味香連膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：六味香連膠囊；柚皮苷；橙皮苷；鹽酸小檗堿；和厚樸酚；厚樸酚；UHPLC

The ana1ysis of70% methano1ic extract of this drugwas performed on Agi1ent XDB-C18co1umn（4.6 mm×50 mm，1.8 μm），mobi1e phase was acetonitri1e（A）-0.2% formic acid（B）in a gradient e1ution manner，detection wave1ength was set at294 nm，injection vo1umewas1 μL，and co1umn temperaturewasmaintained at40℃.RESULTS Naringin，hesperidins，berberine hydroch1oride，honokio1 and magno1ia disp1ayed good 1inear re1ationshipswithin the ranges of 3.78 -189.20 μg/mL（r＝0.999 5），1.28 -64.00 μg/mL（r＝0.999 5），26.78 -1 339.20 μg/mL（r＝0.999 7），1.48 -74.00 μg/mL（r＝0.999 5）and 1.33 -66.60 μg/mL（r＝0.999 9），and their average recoveries（n＝9）were 98.8%，99.0%，99.6%，98.7% and 100.1% with the ISDs of1.7%，1.6%，1.4%，2.2% and 1.6%，respective1y.C0NCLUSI0N Thismethod is simp1e，rapid and reproducib1e，which can be app1ied to the qua1ity contro1of Liuwei Xiang1ian Capsu1es.

KEY W 0RDS：Liuwei Xiang1ian Capsu1es；naringin；hesperidins；berberine hydroch1oride；honokio1；magno1ia；UHPLC

六味香連膠囊由木香、鹽酸小檗堿、枳實、白芍、姜厚樸、檳榔6味藥加工制成，為江西德瑞制藥有限公司獨家品種，具有祛暑散寒、化滯止痢之功效，臨床上用于腸胃食滯、紅白痢癥、腹痛下墜、小便不利等［1］。該方中，枳實可破氣消積、化痰散痞［2］，其活性成分柚皮苷與橙皮苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用［3-6］；鹽酸小檗堿為廣譜抗菌藥，主要用于志賀菌屬、鏈球菌、葡萄球菌、毛癬菌等引起的感染［7-10］；厚樸具有燥濕消痰、下氣除滿［11］的功效，其主要活性成分和厚樸酚與厚樸酚具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、止瀉等藥理活性［12-14］。在該品種試行標(biāo)準(zhǔn)［1］中，采用紫外分光光度法對鹽酸小檗堿進(jìn)行含有量測定，但專屬性不強(qiáng)、效果不佳；采用薄層掃描法測定和厚樸酚與厚樸酚的含有量，但操作繁瑣、重復(fù)性不理想。為了控制該制劑的質(zhì)量，本實驗建立超高效液相色譜（UHPLC）法，同時快速測定膠囊中上述5種成分的含有量，該方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，分析時間短，可為六味香連膠囊的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agi1ent 1290高效液相色譜儀（包括G4220A二元泵、G1316C柱溫箱、G4226A全自動進(jìn)樣器、G4212A二極管陣列檢測器）、Agi1ent XDB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）（美國Agi1ent公司）；Sartorius BSA124S-CW、BT 25S電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥 六味香連膠囊（批號20150101、20150301、20150501）均由江西德瑞制藥有限公司提供。柚皮苷（批號110722-200610）、橙皮苷（批號110721-201316，純度95.3%）、鹽酸小檗堿（批號110713-200208）、和厚樸酚（批號110730-200206）、厚樸酚（批號110729-200006）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；水為超純水（Mi11ipore超純水系統(tǒng)制備）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agi1ent XDB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～1.0 min，10.0%A；1.0～7.0 min，10.0%～33% A；7.0～7.1 min，33%～55% A；7.1～12.0 min，55%～65% A；12.0～12.1 min，65%～95% A；12.1～15.0 min，95%A）；體積流量0.7 mL/min；檢測波長294 nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量1 μL。在該條件下，柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，陰性樣品無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚對照品適量，加70%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為378.40、128.00、2678.40、148.00、133.20 μg/mL的混合對照品儲備液。精密吸取適量，加70%甲醇制成每1 mL分別含柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚37.84、12.80、267.84、14.80、13.32 μg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品內(nèi)容物0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲（500 W、40 KHz）50 min，放冷，再稱定重量，70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液20 mL，置于50 mL量瓶中，70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 分別按處方比例及制劑工藝制備不含鹽酸小檗堿、枳實、厚樸的陰性樣品，再按“2.3”下方法制備陰性對照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備液適量，70%甲醇溶液分別稀釋2、5、10、20、40、100倍，混勻，得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 5個成分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear regression equations and correlation coefficents of five constituents

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液1 μL，在“2.1”項色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的ISD分別為0.2%、0.4%、0.3%、0.2%、0.3%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號20150301），在“2.1”項色譜條件下，于0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果，柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的ISD分別為1.6%、1.1%、1.0%、0.2%、0.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（批號20150301），共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣1 μL，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚平均含有量分別為13.55、7.40、116.92、5.40、5.99 mg/g，ISD分別為1.6%、1.9%、1.4%、1.5%、1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的六味香連膠囊（批號20150301）樣品粉末0.25 g，分低、中、高3個水平，共9份。分別精密加入相當(dāng)于樣品中各成分含有量80%、100%、120%的混合對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 含有量測定 取六味香連膠囊3批（批號20150101、20150301、20150501），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每批3份，記錄峰面積，計算其中柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚的含有量。結(jié)果見表3。

表3 含有量測定結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of content determ ination（n＝3）

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3 討論

3.1 提取條件的選擇 本實驗考察了不同提取方法（回流、超聲）、提取溶劑（70%甲醇、純甲醇、70%乙醇、純乙醇、鹽酸-70%甲醇［1∶100］、鹽酸-純甲醇［1∶100］），溶劑用量（25、50、100 mL），提取時間（30、40、50、60 min）對提取效率的影響。結(jié)果顯示，50 mL 70%甲醇超聲50 min時，提取效果最佳。

3.2 色譜條件的選擇 通過DAD檢測器對供試品色譜在400～190 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)柚皮苷、橙皮苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚分別在283、283、345、294、294 nm波長下有最大吸收峰。比較各波長供試品的色譜圖后，綜合考慮各待測成分在樣品中的含有量，為了使5個成分的響應(yīng)比較均衡，故選擇294 nm作為該方法的檢測波長。

3.3 流動相的選擇 比較了乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)pH＝3.0）流動相，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果，以乙腈-0.2%磷酸為流動相時，色譜中各待測成分均能達(dá)到很好的分離效果。

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Simultaneous determ ination of five constituents in LiuWei Xianglian Capsules by UHPLC

LUO Chen-xuan1，2， LUO Yue-hua1，2， CHENWei-kang2， ZHENG Dong-kun1，2， HUANG Hui-ming1*

（I.School of Pharmacy，Nanchang University，Nanchang 33OOO6，China；2.Jiangχi Provincial Institute for Drug Inspection and Testing，Jiangχi Provincial Engineering &Technology Research Center for Quality of Drugs and Medical Devices，Nanchang 33OO29，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an u1tra high performance 1iquid chromatography（UHPLC）method for the simu1taneous determination of naringin，hesperidins，berberine hydroch1oride，honokio1and magno1ia in Liuwei Xiang1ian Capsu1es（Aucklandia lappa，berberine hydroch1oride，F(xiàn)ructus aurantii immaturus，etc.）.M ETH 0 DS

*通信作者：黃惠明（1966—），男，博士，碩士生導(dǎo)師，從事藥物設(shè)計與合成研究。Te1：13870809536，E-mai1：782897214@qq.com

作者簡介：羅晨煖（1990―），女，碩士生，從事藥物分析研究。Te1：15270892673，E-mai1：470315848@qq.com

收稿日期：2015-10-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.016

中圖分類號：I927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0556-04