補(bǔ)中益氣丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜mRNA表達(dá)的影響

羅 書(shū)， 李燕舞， 巫燕莉， 杜 群（廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州510405）

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補(bǔ)中益氣丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜mRNA表達(dá)的影響

羅 書(shū)， 李燕舞*， 巫燕莉， 杜 群
（廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州510405）

摘要：目的 研究補(bǔ)中益氣丸（黃芪、白術(shù)、陳皮等）對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠結(jié)腸黏膜NOD樣受體蛋白3（Nlrp3）、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（Asc）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（caspase-I）m INA表達(dá)的影響，評(píng)估其對(duì)UC的預(yù)防作用。方法 將60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，柳氮磺砒啶（SASP）對(duì)照組，補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組予3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）造模；正常組、模型組每日給予蒸餾水0.01 mL/g；陽(yáng)性對(duì)照組每日給予柳氮磺砒啶1.33 g/kg；補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量組每日分別給予補(bǔ)中益氣丸12、6、3 g/kg，連續(xù)給藥7 d后，提取結(jié)腸樣本，觀察小鼠結(jié)腸病理變化，實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)結(jié)腸粘膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)水平。結(jié)果 模型組小鼠病理檢測(cè)顯示結(jié)腸上皮糜爛、出血、多病灶淺潰瘍、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而給藥組均不同程度地改善上述癥狀。與空白組、柳氮磺砒啶對(duì)照組比較，模型組Nlrp3表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與補(bǔ)中益氣丸各組比較，沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）；與其它各組比較，模型組Asc、caspase-I m INA表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論 補(bǔ)中益氣丸對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠UC有一定預(yù)防作用，其雖未能抑制Nlrp3表達(dá)，卻能明顯抑制Asc、caspase-I表達(dá)，提示其對(duì)小鼠UC預(yù)防作用機(jī)制可能與抑制結(jié)腸黏膜Asc、caspase-I表達(dá)，阻斷Nlrp3炎性體裝配有關(guān)。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎；補(bǔ)中益氣丸；NOD樣受體蛋白3；凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1

KEY W 0RDS：u1cerative co1itis；Buzhong Yiqi Pi11s；NOD-1ike receptor protein 3（Nlrp3）；apoptosis-associated speck-1ike proteincontaining CAID（Asc）；cysteiny1aspartate specific proteinase-1（caspase-I）

炎癥性腸病是一組病因和發(fā)病機(jī)制不明的慢性腸道非特異性疾病，其病變位于大腸，呈連續(xù)性彌漫分布，多數(shù)累及直腸和乙狀結(jié)腸。潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸病的一種，其典型臨床癥狀包括黏液膿血便和腹痛腹瀉［1］。由于本病病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，且難治愈，易復(fù)發(fā)，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病［2］。葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠UC模型是目前應(yīng)用最為廣泛的模型之一，具有造模簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、成功率較高等特點(diǎn)，且臨床表現(xiàn)、病變部位、病理學(xué)表現(xiàn)與人類UC極其相似，因此在相關(guān)研究中占有重要地位［3］。

NLIP3炎性小體由NLIP3（NOD樣受體蛋白3）、ASC（凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白）和caspase-1（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1）組成。NLIP3炎性小體在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，其激活是一把雙刃劍。一方面，腸腔病原體及其代謝產(chǎn)物等不良因素可以激活NLIP3炎性體，激發(fā)腸道固有免疫發(fā)揮屏障防御作用；另一方面，炎性體的激活可導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1（IL-1）家族炎性因子分泌過(guò)多，加重腸黏膜炎癥反應(yīng)造成腸道損傷［4］。

補(bǔ)中益氣丸由黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸、生姜、大棗組成，具有補(bǔ)中益氣，升陽(yáng)舉陷之功效。李日光［5］以補(bǔ)中益氣丸聯(lián)合柳氮磺吡啶（SASP）治療40例UC患者，總有效率達(dá)90%，療效顯著，證明補(bǔ)中益氣丸對(duì)UC具有確定的療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型，以NLIP3炎性小體為切入點(diǎn)，探討補(bǔ)中益氣丸對(duì)UC的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠，雌性，體質(zhì)量

18～22 g，動(dòng)物合格證編號(hào)44007200014518，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 DSS（分子量為36 000～50 000）由廣州市紅爍林生物科技有限公司提供；SASP由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20130915；補(bǔ)中益氣丸由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)Z11020244；INAiso P1us（貨號(hào)9108）、5×PrimeScript IT Master Mix（貨號(hào)I I 036A）、SYBI Premix Ex Taq II（貨號(hào)G0668）均由寶生物工程（大連）有限公司提供。

1.3 儀器 3K30/V低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；D-8721 PCI儀（日本Takara公司）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；PTC-220熒光定量PCI儀（美國(guó)Bio-Iad公司）。

1.4 分組與造模 將60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，陽(yáng)性藥物對(duì)照組，補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組予3% DSS水溶液代替飲用水1周，隔天更換新鮮DSS水溶液。

1.5 給藥 研磨SASP片和補(bǔ)中益氣丸，制成溶液，于造模同時(shí)給藥，連續(xù)7 d。空白組和模型組每日給予蒸餾水0.01 mL/g；陽(yáng)性藥物對(duì)照組每日給予SASP 1.33 g/kg，按成人等效劑量換算；補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量組每日分別給予補(bǔ)中益氣丸12、6、3 g/kg，分別按成人有效劑量40、20、10倍換算。

1.6 取樣 麻醉處死小鼠，剪取肛門至回盲部的整段結(jié)腸，測(cè)量長(zhǎng)度，沿腸系膜邊緣縱向剖開(kāi)，清理內(nèi)容物，用預(yù)冷生理鹽水清洗，濾紙除去多余水分，稱取結(jié)腸總質(zhì)量，計(jì)算單位結(jié)腸質(zhì)量（單位結(jié)腸質(zhì)量＝結(jié)腸總質(zhì)量/結(jié)腸長(zhǎng)度）。

1.7 病理組織觀察 截取中段結(jié)腸0.5 cm，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為5 μm，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察黏膜完整性、黏膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及腸腺體改變。

1.8 結(jié)腸黏膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)

1.8.1 提取總INA 取結(jié)腸樣本100 mg，加入1 mL INAiso P1us，冰上充分研磨，室溫靜置5 min，12 000×g，4℃，離心5 min；取上清于新離心管中，加入200 μL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min，12 000×g，4℃，離心15 min；取上清于新離心管中，加入同體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12 000×g，4℃，離心10 min；棄上清保留沉淀，加入1 mL 75%酒精，反復(fù)吹打，12 000×g，4℃，離心5min；棄上清，保留沉淀，待酒精揮發(fā)后，加入50 μL去離子水，溶解沉淀，-20℃保存。

1.8.2 引物合成 查閱文獻(xiàn)，確定Nlrp3、Asc、caspase-I的引物，以Gapdh為內(nèi)參，引物核苷酸序列見(jiàn)表1，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 qPCR Primer sequences

1.8.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 參照5×PrimeScript IT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s，4℃終止。

1.8.4 qPCI反應(yīng) 參照SYBI Premix Ex TaqⅡ熒光物質(zhì)試劑盒說(shuō)明操作。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，39個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min。

1.8.5 qPCI結(jié)果 采用2-△△Ct法，以模型組小鼠結(jié)腸m INA表達(dá)為參照，對(duì)結(jié)果行相對(duì)定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)以±s進(jìn)行表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸質(zhì)量結(jié)果 由表2可見(jiàn)，與空白組比較，模型組結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)中益氣丸低劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度增長(zhǎng)（P＜0.05），補(bǔ)中益氣丸高、中劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組結(jié)腸質(zhì)量增加（P＜0.05）；與模型組比較，用藥組結(jié)腸質(zhì)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），但有下降的趨勢(shì)。

表2 結(jié)腸長(zhǎng)度和質(zhì)量（±s，n＝8）Tab.2 Lengths and Weights of colon（±s，n＝8）

表2 結(jié)腸長(zhǎng)度和質(zhì)量（±s，n＝8）Tab.2 Lengths and Weights of colon（±s，n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　結(jié)腸長(zhǎng)度/cm單位結(jié)腸質(zhì)量/（g·cm-1）空白組6.46±0.32　0.022±0.003模型組　4.88±0.56*　0.031±0.003*陽(yáng)性對(duì)照組　6.00±0.35△　0.029±0.003補(bǔ)中益氣丸高劑量組　5.06±0.56　0.030±0.004補(bǔ)中益氣丸中劑量組　5.58±0.18　0.029±0.002補(bǔ)中益氣丸低劑量組　6.08±0.41△0.029±0.002

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 HE染色顯示（圖1），空白組小鼠結(jié)腸未見(jiàn)明顯病理變化；模型組小鼠結(jié)腸腺體全部消失，黏膜水腫，黏膜下大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量組均見(jiàn)腺體大部分消失，黏膜不同程度的水腫，黏膜下大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 結(jié)腸粘膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)結(jié)果 由表3可見(jiàn)，與空白組比較，模型組Nlrp3表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)減少（P＜0.05），補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量組表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組Asc表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)中益氣丸組表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。與空白組比較，模型組caspase-I表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)中益氣丸高、中劑量組表達(dá)顯著減少（P＜0.05），但補(bǔ)中益氣丸低劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

UC是原因不明的累及全腸的非特異性炎癥，以腹瀉、黏液血便、腹痛、里急后重為主要特征，并伴有乏力、消瘦、飲食欲下降等全身癥狀。屬于中醫(yī)“痢疾”、“滯下”、“腸風(fēng)”、“泄瀉”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，該病病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。本虛責(zé)之于脾，因此，防治UC當(dāng)以益氣健脾入手。史柯［6］以益氣健脾法治療41例UC患者，總有效率達(dá)92.7%，體現(xiàn)了益氣健脾法在UC防治上的作用。補(bǔ)中益氣丸是健脾益氣的經(jīng)典方，由黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸、生姜、大棗組成，臨床將之用于治療UC取得較好療效。

圖1 補(bǔ)中益氣丸對(duì)UC模型小鼠結(jié)腸組織病理組織學(xué)的影響（HE，×100）Fig.1 Effect of BZYQ colon histopathology in m iceWith ulcerative colitis（HE，×100）

表3 結(jié)腸黏膜Nlrp3，Asc，caspase-1的mRNA表達(dá)量（±s，n＝8）Tab.3 Nlrp3，Asc and caspase-1 m RNA expressions in colonic mucosal（±s，n＝8）

表3 結(jié)腸黏膜Nlrp3，Asc，caspase-1的mRNA表達(dá)量（±s，n＝8）Tab.3 Nlrp3，Asc and caspase-1 m RNA expressions in colonic mucosal（±s，n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別Nlrp3　Asc　caspase-I空白組0.177±0.029 0.246±0.035　 0.234±0.028模型組　0.943±0.079*0.967±0.090*0.984±0.124*陽(yáng)性對(duì)照組　0.456±0.049△0.369±0.105△0.439±0.061△補(bǔ)中益氣丸高劑量組　0.804±0.077 0.378±0.086△0.567±0.069△補(bǔ)中益氣丸中劑量組　0.801±0.089 0.422±0.064△0.447±0.063△補(bǔ)中益氣丸低劑量組　0.868±0.131 0.618±0.090△0.863±0.102

DSS是由蔗糖合成的一種硫酸多糖體，能誘發(fā)UC。王顯飛等［7］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)單個(gè)循環(huán)飲用3% DSS可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生與人類臨床和病理表現(xiàn)相似的結(jié)腸炎。該模型制作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，重復(fù)性好，可用于UC發(fā)病機(jī)制、病理變化和藥物療效評(píng)估的研究，應(yīng)用廣泛［8］。

NLIP3是NOD樣受體家族的主要成員，近年研究表明其參與維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定，并與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)［9］。NLIP3炎性小體由NLIP3、ASC和caspase-I組成。NLIP3的激活可致其熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrindomain，PYD）與ASC 的PYD連接，致ASC的胱天蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CAID）與caspase-I 的CAID結(jié)合，完成NLIP3炎性體的裝配從而活化caspase-I進(jìn)而參與腸道免疫反應(yīng)［10］。Bauer等［11-12］研究表明，DSS可通過(guò)NLIP3炎性體的裝配，激活caspase-I從而誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥損傷，NLIP3基因敲除以及對(duì)caspase-I藥理抑制可有效減輕DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癥狀。Wu等［13］研究表明，抑制NLIP3炎性體的激活可能是治療炎癥性腸病（inf1ammatory bowe1 disease，IBD）的途徑。但Zaki等［14］卻認(rèn)為，腸道NLIP3基因缺陷可以導(dǎo)致腸粘膜屏障通透性增強(qiáng)，誘導(dǎo)有害免疫反應(yīng)，進(jìn)而加重IBD過(guò)程中腸粘膜損傷。

本研究采用3% DSS誘導(dǎo)小鼠UC，同時(shí)給予補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量和SASP進(jìn)行預(yù)防干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSS飲水可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠出現(xiàn)黏液血便、消瘦以及腸黏膜的急性炎癥損傷，補(bǔ)中益氣丸高、中、低劑量及SASP均能在不同程度上改善DSS模型組小鼠的結(jié)腸損傷程度及小鼠生存狀態(tài)。針對(duì)NLIP3炎性體進(jìn)一步研究顯示，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)均顯著增高，提示炎性體的激活可能是DSS誘導(dǎo)腸黏膜損傷的直接因素。同時(shí)，益氣健脾復(fù)方及臨床常用抗炎藥物SASP預(yù)防給藥對(duì)NLIP3炎性體復(fù)合物的基因表達(dá)均有顯著的抑制作用。其中補(bǔ)中益氣丸能顯著抑制Asc和caspase-I的m INA表達(dá)，SASP則對(duì)Nlrp3、Asc、caspase-I的表達(dá)均明顯抑制。可見(jiàn)，預(yù)防給予抗炎或益氣健脾復(fù)方，可在不同程度加強(qiáng)腸黏膜的抗損傷能力，其作用機(jī)制可能與抑制Asc的表達(dá)，阻斷Nlrp3炎性體的裝配，阻止caspase-I活化有關(guān)。研究為臨床UC預(yù)防治療及緩解期用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Buzhong Yiqi Pills on m RNA expression in colonic mucosal of m ice With ulcerative colitis

LUO Shu， LIYan-wu*， WU Yan-1i， DU Qun

（Institute of Spleen and Stomach，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 5IO4O5，China）

ABSTRACT：AIM To exp1ore the effects of Buzhong Yiqi Pi11s（Astragalusmembransaceus，Atractylodesmacrocephala，Citrus reticulatea，etc.）on Nlrp3，Asc and caspase-I expressions in co1onicmucosa1ofmice with u1cerative co1itis and to eva1uate its preventive effects against u1cerative co1itis.METH0 DS Sixty C57BL/6 micewere random1y divided into the norma1 group，mode1 group，positive contro1 group，Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groups，with ten mice in each group.Mice in themode1group，positive contro1group，Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groupswere treated with 3% DSS.Mice in the positive contro1group were treated with 1.33 g/kg SASP，mice in the Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groups were treated with 12 g/kg，6 g/kg and 3 g/kg Buzhong Yiqi Pi11s，respective1y，and mice in the norma1group and mode1group were treated with 0.01 mL/g disti11ed water.A11 the groupswere treated for seven consecutive days.After seven days，the patho1ogica1 changes in co1onic mucosa1ofmice were observed.Meanwhi1e，m INA expressions of Nlrp3，Ascbook=486,ebook=20and caspase-I were detected by IT-qPCI ana1ysis.RESULTS Compared with the norma1 group，the mode1 group’s patho1ogica1examination showed co1on epithe1ia1 erosion，b1eeding，mu1tifoca1 u1cers and numerous inf1ammation ce11s infi1trating.However，the symptomswere improved in other groups.The expression of Nlrp3 m INA in themode1group was obvious1y higher than that in the norma1group and positive contro1group（P＜0.05），which was not different from a11 the Buzhong Yiqi Pi11s groups（P＞0.05）.The expressions of Asc and caspase-I m INA in the mode1group were obvious1y higher than those in another groups（P＜0.05）.C0NCLUSI0N Buzhong Yiqi Pi11s show certain preventive effects against DSS-induced u1cerative in mice.They do not inhibit the expression of Nlrp3，but inhibit the expressions of Asc and caspase-I.Themechanism of preventing the u1cerative co1itis in micemay be re1ated to the inhibition of Asc m INA and caspase-I m INA expressions to b1ock the formation of Nlrp3 inf1ammasome.

*通信作者：李燕舞（1976—），女，博士，副研究員，從事胃腸黏膜損傷及中藥復(fù)方的防治機(jī)制研究。Te1：（020）36585555，E-mai1：1yw_ 7614@126.com

作者簡(jiǎn)介：羅 書(shū)（1988—），男，碩士生，從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。Te1：18819324404，E-mai1：1uoshu088323@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202627）；華南中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心-中醫(yī)藥防治脾胃病、腦病創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（A1-AFD01514A05）

收稿日期：2015-10-16

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.003

中圖分類號(hào)：I285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0485-05