腦絡通顆粒對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化血管重構的影響

嚴士海， 張建平， 王海丹， 高 峰， 朱長樂（.南京中醫藥大學附屬醫院科技處，江蘇南京009；.浙江省奉化市人民醫院藥劑科，浙江奉化35500）

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腦絡通顆粒對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化血管重構的影響

嚴士海1， 張建平2， 王海丹1， 高 峰1， 朱長樂1
（1.南京中醫藥大學附屬醫院科技處，江蘇南京210029；2.浙江省奉化市人民醫院藥劑科，浙江奉化315500）

摘要：目的 觀察腦絡通顆粒（制首烏、黃精、海藻等）對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的影響。方法 高脂飼料飼養30只ApoE-/-小鼠10個月，隨機分為模型組、腦絡通組（6.67 g/kg）、辛伐他汀組（6.67 mg/kg），每組10只。給藥后小鼠取血清，生化法檢測血脂；取主動脈，Masson染色法觀察血管膠原/面積比；Wetern b1ot檢測基質金屬蛋白酶2（MMP2）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、膜型基質金屬蛋白酶1（MT1-MMP）、基質金屬蛋白酶抑制劑1 （TIMP1）、基質金屬蛋白酶抑制劑2（TIMP2）的水平。結果 腦絡通能調整血脂水平，使血管膠原/面積比增加（P＜0.01），明顯降低MMP2、MMP9、MT1-MMP水平（P＜0.05），明顯升高TIMP1、TIMP2水平（P＜0.05）。與辛伐他汀組相當。結論 腦絡通具有改善血管重構的作用，其機制可能與降低MMP2、MMP9、MT1-MMP水平，增加TIMP1、TIMP2的表達有關。

關鍵詞：腦絡通顆粒；ApoE-/-小鼠；動脈粥樣硬化；基質金屬蛋白酶（MMP2、MMP9）；膜型基質金屬蛋白酶1 （MT1-MMP）；基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMP1、TIMP2）

KEY W 0RDS：Nao1uotong Granu1es；ApoE-/-mice；atherosc1erosis；MMP2 and MMP9；MT1-MMP；TIMP1 and TIMP2

動脈粥樣硬化（atherosc1erosis，AS）是冠心病、腦中風的病理基礎，嚴重威脅人類健康。大量研究發現，基質金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制劑參與了機體發生AS時的血管重構、斑塊破裂等一系列病理生理過程［1］。最新研究發現MMPs在AS斑塊內呈過度表達，通過降解細胞外基質（ECM）使血管斑塊頂部變薄，導致斑塊易破裂出血。腦絡通顆粒是南京中醫藥大學附屬醫院院內制劑，由制首烏、黃精、海藻、水蛭、川芎組成，具有滋腎養肝、化痰消瘀等作用，臨床研究顯示其在降低AS患者血脂水平、改善血液流變學參數、治療中風后遺癥等方面有很大的價值［2］，但其對血管壁重構是否有作用值得研究。本實驗通過觀察腦絡通對ApoE-/-小鼠AS模型血管膠原/血管面積比、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、基質金屬蛋白酶9 （MMP9）、膜型基質金屬蛋白酶1（MT1-MMP）、基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）、基質金屬蛋白酶抑制劑2（TIMP2）水平的影響，以期進一步探討該藥物在血管壁重構方面的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗用藥 腦絡通顆粒（制首烏30 g、黃精15 g、海藻10 g、水蛭6 g、川芎10 g），制法為取制首烏、黃精、海藻、川芎4味藥水煮醇沉，水蛭水提，分別濃縮，加入糊精，流化床制粒，每1 g顆粒劑相當于生藥3.5 g（南京中醫藥大學附屬醫院制劑部，批號20120220）；辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司生產，批號120710）。

1.2 實驗動物 ApoE-/-小鼠30只，SPF級，8周齡，體質量（20±2）g，雄性，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，實驗動物許可證號SCXK（京）2011-0012。

1.3 實驗飼料 高脂飼料（江蘇協同醫藥生物工程有限公司，批號20120322）。

1.4 實驗條件 小鼠均分籠飼養，按不同組別分別飼喂全價營養顆粒飼料及高脂飼料，自由飲水，室溫（22±2）℃，濕度55%～65%，光照適度，通風潔凈良好。

1.5 實驗用儀器 FA1004型電子分析天平（上海精密科學儀器廠）；752分光光度計（上海分析儀器廠）；Western電泳儀（164-5051，美國Bio-Iad）；高速冷凍離心機（D-37520，美國Sorva11）；紫外光度儀（UV-2450，日本Shimadzu）；凝膠成像儀（Ge1Doc XI，美國Bio-Iad）。

1.6 實驗用試劑 膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，（日本第一化學藥品株式會社，批號20130402）；全蛋白抽提試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號20130527）；Braford蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號201300118）；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（南京凱基生物科技發展有限公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號20130309）；MMP2（美國Santa cruz，貨號Sc-6838）；MMP9（美國Santa cruz，貨號Sc-6840）；MT1-MMP（美國Santa cruz，貨號Sc-30074）；TIMP1（美國Biowor1d，貨號BS1697）；TIMP2（英國Abcam，貨號ab1828）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 模型組，等量蒸餾水；辛伐他汀組，6.67 mg/kg；腦絡通組，6.67 g生藥/kg，按相當于人臨床劑量的10倍選擇此劑量。

2.2 模型與干預 ApoE-/-小鼠，分為模型組、辛伐他汀組、腦絡通組，給予高脂飼料10個月，經病理學檢測確認模型成功后，根據分組給藥治療2個月。末次給藥1 h后，脫頸椎處死小鼠，取主動脈（接近心臟1 cm），分成兩部分，一部分行Masson染色，另一部分予液氮保存，待檢測。

2.3 血管Masson染色與評價 血管標本采用Masson染色法，用Image p1us 5.1圖像分析軟件測量主動脈根部膠原面積（CA），計算膠原/血管面積比（CA/CVA）。

2.4 TIMP1、TIMP2、MMP2、MMP9、MT1-MMP蛋白表達測定 采用Western b1ot法。提取血管蛋白，蛋白樣品處理后進行SDS-PAGE，轉膜，染色，封閉，一抗二抗孵育，加發光液，曝光。保存顯示有目的條帶的膠片，以β-Actin為內參照，應用圖象分析儀對條帶做掃描半定量。

2.5 數據統計 應用SPSS 15.0軟件包處理分析數據，資料數據均用均數±標準差（±s）表示，數據先進行方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著意義，P＜0.01為差異有非常顯著意義。

3 實驗結果

3.1 腦絡通對主動脈的影響 病理結果（圖1，×200）顯示，主動脈有斑塊，血管壁出現沉積的脂質-泡沫細胞及針形的膽固醇結晶。

圖1 主動脈內斑塊病理圖（×200）Fig.1 Pathologic figure of aortic p laque（×200）

3.2 腦絡通對血脂的影響 腦絡通血清TC、TG、LDL-C的量比模型組明顯下降，具有顯著性差異（P＜0.01）；腦絡通與辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C也顯著下降，存在顯著性差異（P＜0.01）；辛伐他汀組與腦絡通組的差異不顯著（P＞0.05）。提示腦絡通對升高的ApoE-/-小鼠血脂水平具有調節作用。見表1。

表1 3組小鼠血脂水平（mmol/L，±s）Tab.1 Lipid levels in three groups of m ice（mmol/L，±s）

表1 3組小鼠血脂水平（mmol/L，±s）Tab.1 Lipid levels in three groups of m ice（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別　動物數/只TC　TG　LDL-C模型組10　 28.93±2.62 1.92±0.28　 9.73±1.69腦絡通組　10　 17.28±1.47**1.55±0.30**2.97±0.75**辛伐他汀組　10　 15.20±1.95**1.48±0.20**2.41±0.45**

3.3 腦絡通對膠原/血管面積比的影響 模型組斑塊的膠原含有量及占斑塊的面積比值為12.68%。分別給予辛伐他汀、腦絡通治療后，ApoE-/-小鼠主動脈組織中膠原增加，與模型組相比，具有顯著性差異（P＜0.01）。3組都出現脂質斑塊，板塊內有膠原生長（綠色染色部分），辛伐他汀、腦絡通組膠原增多。具體結果見表2、圖2。

3.4 腦絡通對血管組織中MMP2、MMP9、MT1-MMP、TIMP1、TIMP2表達的影響 腦絡通可以下調ApoE-/-小鼠血管中MMP2、MMP9、MT1-MMP的表達，同時升高TIMP1、TIMP2的表達，與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05），與辛伐他汀組比較無顯著性差異（P＞0.05）。結果見圖3。

表2 3組小鼠膠原/血管面積比（%，±s，n＝6）Tab.2 Ratios of collagen to vascular area in three groups ofm ice（%，±s，n＝6）

表2 3組小鼠膠原/血管面積比（%，±s，n＝6）Tab.2 Ratios of collagen to vascular area in three groups ofm ice（%，±s，n＝6）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別　　膠原/血管面積比模型組12.68±3.72腦絡通組　20.56±4.07**辛伐他汀組　17.88±4.35**

圖2 3組小鼠主動脈M asson染色代表圖（×100）Fig.2 Representative images of M asson staining aortic p laque in three groups ofm ice（×100）

4 討論

圖3 腦絡通顆粒對MMP2、MMP9、MT1-MMP、TIMP1、TIMP2表達的影響（n＝3）Fig.3 Effects of Naoluotong Granules on MMP2，MMP9，MT1-MMP，TIMP1 and TIMP2 levels（n＝3）

近年來，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠已成為研究AS發病機制的最重要的動物模型。高脂飼料能加速AS模型的形成。隨著年齡的增加，ApoE-/-小鼠動脈斑塊面積逐步增大，斑塊內脂質、細胞外基質成分逐步增多，而膠原和平滑肌細胞逐步減少，其斑塊具備易損斑塊的特征［3］。所以，ApoE-/-小鼠是研究AS和不同階段AS的理想模型。

血管膠原/血管面積比可以反應易損斑塊的特征。本實驗研究發現，在給予腦絡通、辛伐他汀分別治療后，相比模型組，腦絡通組與辛伐他汀組血管膠原/血管面積比增加，提示其具有抑制易損斑塊的作用。

MMP是一類Zn2＋依賴性內肽酶。在AS這一病理過程中，MMP2、MMP9降解細胞外基質，削弱斑塊表面纖維帽成分，使其抵抗應力的作用減弱，使AS斑塊易于發生破裂，繼而發生血栓的形成和機化［4-5］。本實驗研究發現，在分別給予腦絡通、辛伐他汀分別治療后，ApoE-/-小鼠主動脈組織中MMP2與MMP9的量均降低，提示腦絡通可能通過抑制主動脈組織中MMP2與MMP9的表達，起到穩定斑塊的作用，其抑制程度與辛伐他汀組相當。

MT1-MMP是比較特殊的一類MMPs，它的氨基末端含有一個跨膜結構域，使其錨定在細胞表面，其主要的生物學特征是能夠結合并激活MMP-2。本實驗研究發現，在分別給予腦絡通、辛伐他汀治療后，ApoE-/-小鼠主動脈組織中MT1-MMP的表達均降低，提示腦絡通可以抑制ApoE-/-主動脈組織中MT1-MMP的表達。

MMPs的主要生理抑制劑是TIMPs，主要包括TIMP1、TIMP2。TIMPs能夠抑制MMPs的活性，其中TIMP1主要抑制MMP-1、-3、-9，而TIMP2主要抑制MMP2。資料顯示［6-7］，正常內皮細胞和平滑肌細胞有TIMPs和MMPs的表達，以共同維持細胞外基質合成與降解的平衡。本實驗研究發現，在分別給予腦絡通、辛伐他汀治療后，ApoE-/-小鼠主動脈組織中TIMP1、TIMP2的量均升高。

腦絡通顆粒由制首烏、黃精、海藻、水蛭、川芎組成［8-9］，以制首烏為君，其味甘澀，性溫，具有補益精血，滋腎養肝之功效。何首烏提取物可以影響核因子κB（NF-κB）等炎性因子的表達，抑制動脈粥樣硬化斑塊的膠原纖維降解，從而穩定斑塊，預防斑塊的破裂［10］。此類患者常感陰傷兼有氣耗，筋骨無力，故以黃精輔佐首烏為臣，取其味甘，性平，具養陰益氣，滋腎填精之功，其提取物黃精多糖具有降脂與抗AS的作用［11］。此外，痰瘀久痹，化、消必有較長時日，峻猛破伐之品，自非所宜，選藥在于既具消、化之功，能除脈中之痰瘀，又可久用而不傷正，故以海藻、水蛭、川芎為佐。其中，海藻咸寒，有軟堅化痰之功，能祛經隧膠著之痰；水蛭味咸苦性平，具逐血破結軟堅之效。小量常服，活血化瘀而不傷正，痰濁得化，瘀血得消，血脈自暢。海藻、水蛭、川芎都可通過減輕氧化損傷、抑制炎癥反應等環節，起到抗AS的作用［12］。全方標本兼顧，消補兼施，補虛不忘瀉實，祛邪不忘扶正，共奏滋腎養肝、化痰消瘀之效，且藥性平和，藥證合拍，宜于久服。

綜上所述，與模型組比較，腦絡通組血管膠原/血管面積比增大，同時MMP2、MMP9、MT1-MMP水平明顯降低，TIMP1、TIMP2明顯升高，提示腦絡通對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血管基質重構具有調節作用。

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Effect of Naoluotong Granules on atherosclerotic vascular remodeling in ApoE-/-m ice

YAN Shi-hai1， ZHANG Jian-ping2， WANG Hai-dan1， GAO Feng1， ZHU Chang-1e1

（I.Science and Technology Department，Hospital Affiliated to NanJing University of Traditional Chinese Medicine，NanJing 2IOO29，China；2.Pharmacy Department，ZheJiang Provincial Fenghua People’s Hospital，Fenghua 3I55OO，China）

ABSTRACT：AIM To observe the effect of Nao1uotong Granu1es（Polygonimultiflori Radi，Polygonati Rhizoma，Sargassum，etc.）on atherosc1erotic vascu1ar remode1ing in ApoE-/-mice.METH 0DS Thirty ApoE-/-mice were fed with high fat diet for ten months and then equa11y assigned to themode1group，Nao1uotong Granu1es group（6.67 g/kg）and Simvastatin group（6.67 mg/kg）.Aftermedication，mice serum was taken for detecting b1ood 1ipid by biochemica1method，the ratio of co11agen to vesse1 area co11ected from aortic wa11was detected by Masson staining.The 1eve1s of MMP2，MMP9，MT1-MMP，TIMP1 and TIMP2 were examined by Western b1ot. RESULTS Nao1uotong Granu1es corrected the b1ood 1ipid 1eve1，increased the ratio of co11agen to vesse1 area （P＜0.01），decreased the expressions of MMP2，MMP9 and MT1-MMP（P＜0.05），and increased the expressions of TIMP1 and TIMP2（P＜0.05）.This group was found to be equiva1ent to Simvastatin group.C0 NCLU-book=481,ebook=15SION Nao1uotong Granu1es can improve atherosc1erotic vascu1ar remode1ing by decreasing the expressions of MMP2，MMP9 and MT1-MMP and increasing the expressoions of TIMP1 and TIMP2.

作者簡介：嚴士海（1978—），男，碩士，副主任中藥師，研究方向為中藥藥理學。Te1：（025）86555797，E-mai1：973580966@qq.com

基金項目：國家自然科學基金（81302902）；江蘇省自然科學基金（BK20151355）

收稿日期：2014-09-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.002

中圖分類號：I285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0480-05