調肝活血湯聯合palomo手術對精索靜脈曲張癥患者精漿氧化應激干預的研究?

古宇能，陳慰填，溫志鵬△，曾楊玲，陳德寧

(1.深圳市中醫院，廣東深圳518033;2.廣州中醫藥大學，廣州510006)

調肝活血湯聯合palomo手術對精索靜脈曲張癥患者精漿氧化應激干預的研究?

古宇能1，陳慰填1，溫志鵬1△，曾楊玲2，陳德寧1

(1.深圳市中醫院，廣東深圳518033;2.廣州中醫藥大學，廣州510006)

目的:觀察經驗方“調肝活血湯”聯合palomo手術對精索靜脈曲張癥患者精漿氧化應激的影響。方法:選取99名精索靜脈曲張癥相關不育患者分成3組。試驗組(G1)采用調肝活血湯聯合palomo手術治療，中藥對照組(G2)單獨采用調肝活血湯口服，手術對照組(G3)采用palomo手術共6個月，觀察治療前后精液質量和精漿ROS、NO、SOD、TAC的變化情況。結果:試驗組精液質量和精漿TAC、SOD水平顯著改善;ROS和NO有所降低，與對照組比較差異有統計學意義。結論:調肝活血湯聯合palomo術能干預精漿中氧化應激反應，從而提高精液質量。

調肝活血湯;palomo手術;精索靜脈曲張癥;氧化應激

男性不育癥是讓眾多家庭深感苦惱的疾病，也是男科學研究的重要領域［1］。臨床常見類型為先天性生殖器官畸形、性功能障礙、精液質量下降等，其中弱精子癥、少精子癥及精子形態異常是最主要的原因。精索靜脈曲張癥(varicocele，VC)是與不育癥相關的重要疾病，這在20世紀50年代就得到證實［2］。傳統治療VC多采用手術或者藥物栓塞，效果有限且并發癥多。筆者采用經驗方“調肝活血湯”聯合經典術式——Palomo術治療VC相關不育癥，并開展相關實驗研究，現報道如下并對其機理作一探討。

1 臨床資料

1.1 病例選擇

選取2012年11月至2014年9月在深圳市中醫院男科門診就診的不育癥患者99例，男性年齡最大46歲，最小27歲，平均年齡32歲;病程最短1年，最長4年，平均病程2年6個月。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準精索靜脈曲張分度標準:按照曲張程度由輕到重劃為4個等級［3］:①亞臨床型:體檢為陰性，超聲在平靜呼吸狀態下探及精索靜脈內無返流，做Valsalva動作時有返流，DR: 1.8～2.1 mm，TR:1～2 s;②精索靜脈曲張Ⅰ級:體檢觸診為陽性，做Valsalva動作時有返流，平靜呼吸時DR:2.2～2.7 mm，TR:2～4 s;③精索靜脈曲張Ⅱ級:體檢觸診陽性，做Valsalva動作時有返流，DR:2.8～3.1 mm，TR:4～6 s;④VCⅢ級:觸診呈陽性，平靜呼吸時DR≥3.1 mm，TR≥6 s，做Valsalva動作時返流明顯。男性不育癥標準:參考《WTO人類精液及精子—宮頸黏液相互作用實驗檢驗手冊》(第五版):育齡夫妻婚后同居1年以上，性生活正常而未采用任何避孕措施，由于男性方面原因造成女方不孕者;精子濃度＜15×106/ml為少精子癥;前向運動精子比例＜32%為弱精子癥。

1.2.2 中醫診斷標準根據《中藥新藥臨床研究指導原則》精索靜脈曲張證型制定:肝氣郁結證:癥見精索靜脈擴張，陰囊下垂，煩躁，情緒波動易怒，胸脅脹痛，腹部脹滿，舌紅苔黃，脈弦;氣滯血瘀證:精索靜脈擴張、盤曲成團，陣發性脹痛或刺痛，久站或勞累后加重，舌暗有瘀斑，脈弦細［4］。

1.2.3 納入標準符合男性不育癥診斷標準;符合肝氣郁結證或氣滯血瘀證者;CASA檢測確定同時為少精子癥和弱精子癥者;單側Ⅱ度以上精索靜脈曲張或雙側I度以上精索靜脈曲張患者。

1.2.4 排除標準對實驗藥物過敏者;年齡在20歲以下或55歲以上;具有泌尿生殖系統炎癥、先天生殖器官畸型、勃起功能障礙或早泄、染色體異常者;具有嚴重的慢性疾病如肝硬化、肺結核、惡性腫瘤、心肌梗死者;患者配合度差，可能無法遵醫囑完成研究全過程者;具有不良嗜好如酗酒、熬夜，或服用對精子有明確影響的藥品者;長期工作在高輻射、高溫環境者。

1.2.5 脫落標準用藥過程中發生明顯身體不適或嚴重不良反應中出現并發癥;或因出現新的疾病不合適繼續接受試驗者。

2 方法

2.1 實驗設計

采用隨機區組設計的設計方案。根據區組隨機化原則，將接收研究的患者編為33個區組，將每一區組的3位患者各自分配到試驗組(G1)和中藥對照組(G2)、手術對照組(G3)，這樣可以避免研究時間較長導致的非同期對照偏倚及組間人數差異過大。

2.2 治療方法

2.2.1 G1組(試驗組)采用經皮小切口腹膜外超選擇性精索內靜脈高位結扎術(高位血管集束結扎法)。手術方式:定位在髂前上嵴內側約3 cm，平行于腹股溝韌帶，取內環上方3 cm開口，長約2～3 cm。先切開皮膚，逐步分離至后腹膜腔，然后打開精索筋膜，尋找固定精索內靜脈大約3～4 cm，切斷后兩斷端雙重結扎。探查陰囊，尋找剩余充盈的精索內靜脈分支并逐一縫扎細小的靜脈分支。最后用4號絲線皮內美容縫合皮膚切口，不拆線。術后3 d開始口服經驗方“調肝活血湯”:柴胡10 g，白芍20 g，桔梗10 g，枳殼20 g，牛膝10 g，橘核10 g，桃仁10 g，紅花5 g，當歸10 g，生地10 g，川芎5 g，水蛭5 g。中藥飲片由深圳和順堂藥業有限公司提供，深圳市中醫院制劑室按照常規煎藥方法制作)，治療時間為6個月。治療結束后連續隨訪3個月。

2.2.2 G2組(中藥對照組)口服“調肝活血湯”每日1劑，分2次服，治療時間為6個月，治療結束后連續隨訪3個月。

2.2.3 G3組(手術對照組)單獨采用Palomo術，手術后按常規方式抗菌消炎，給予一定營養支持，不適用任何可能對生育有影響的藥物及理療方式，術口愈合后出院，1個月內不做劇烈運動，隨訪3個月。

2.3 觀察指標

治療前后分別檢測精液質量分析(CASA)，記錄精液常規指標(精子密度、前向精子比例、精子活動率、畸形率);測定活性氧(reactive oxy-gen species，ROS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)水平，記錄治療前后和治療過程中的臨床癥狀，進行血、尿、糞常規化驗和肝、腎功能檢查。

2.4 檢驗方法

2.4.1 精液收集患者禁欲2～7 d，自慰或女方幫助手淫取得精液置于專用容器中，再保存于37℃溫箱中，30 min后上機檢查。

2.4.2 精液常規參數測定采用北京偉力彩色精子質量檢測系統(BJWL 9000)，分析精子密度、精液量、精子活動率、前向精子比例，標準參考世界衛生組織推薦的指南。

2.4.3 精子畸形指數采用Diff-Quik法染色檢測。

2.4.4 精漿ROS測定精液ROS水平用化學發光法檢測。400 μL完全液化后的精液加入一次性照度計容器內，取4 μL魯米諾儲存液，同時加入8 μL辣根過氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根過氧化物酶，310 U/mg)。使用Berthold照度計檢測化學發光信號約5 min直至達到穩定。為平衡精子密度對各組ROS水平帶來的混雜作用，按照下式計算調整各組ROS水平:平衡精子密度后的ROS水平=相對化學發光強度(RLU/s)×20×106/精子密度(精子數/ml)×0.4 ml，計算后的ROS單位為RLU/s每20×106精子。

2.4.5 精漿TAC的測定精漿中總抗氧化能力可用增強化學發光法來測定。冷凍的精漿樣品在室溫下解凍后立即進行TAC測量。精漿用去離子水(dH2O)1∶20稀釋后0.20 um濾器過濾。信號試劑的配制:30 ul H2O2(8.8 mol/L)，10 ul對-碘酚儲備液(41.72 umol/L)，110 ul魯米諾儲備液(3.1 mmol/L)，10 ml Tris緩沖液(0.1 mol/L pH8.0)。HRP工作液的配制是將HRP儲備液按1∶1用dH2O稀釋產生3×107cpm的化學發光值。

2.4.6 SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定精漿中SOD活力。冷凍的精漿在室溫下解凍至4℃作為待測樣品。WST-1可與黃嘌呤氧化酶催化產生的超氧化物陰離子反應產生水溶性的甲染料，該反應步驟可以被SOD所抑制。通過對WST-1產物的比色分析即可計算SOD酶活力。

2.4.7 NO測定采用比色法，收集解凍的精漿，酶標儀550 nm處測吸光度值，每個樣品3個復孔取均值。根據標準孔作出亞硝酸鉀濃度-吸光度值標準曲線，依據樣品孔吸光度值在標準曲線上求得各樣孔濃度，記作精漿中NO水平。以上檢驗由深圳市中醫院臨床細胞分子生物學實驗室測定。

2.5 統計學方法

采用SPSS 10.0 for windows計算軟件先進行方差齊性分析，等級資料采用Ridit檢驗，計量資料采用隨機區組設計資料的方差分析，并進一步作兩兩比較，組內前后采用配對檢驗，脫落病例采用末次觀測結轉法填補缺失數據，P≤0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組精液質量和精子畸形率比較

表1顯示，G1組、G2組、G3組治療后精子畸形率、精子密度、前向精子運動比例、精子活動率均優于治療前，差異有統計學意義(P＜0.05);治療后G1組與G2、G3組比較差異有統計學意義，G1組為佳(P＜0.05)。

表1 各組治療前后精液質量、精子畸形率比較(±s)

表1 各組治療前后精液質量、精子畸形率比較(±s)

注:與治療前比較:△P＜0.05;與G2組比較:▲P＜0.05;與G3組比較:●P＜0.05

組別例數時間精子密度(×106/ml)前向運動精子比例(%)精子活動率(%)精子畸形率(%) G1組33治療前10.19±2.24 13.08±2.40 21.62±3.58 74.71±9.04治療后54.13±4.76△▲●42.53±1.18△▲●51.34±6.07△▲●32.25±6.3△▲●G2組33治療前10.26±1.90 14.37±2.71 20.97±3.58 74.46±9.24治療后37.44±3.06△27.94±3.58△36.49±1.87△54.09±6.14△G3組33治療前10.26±1.46 13.97±2.70 20.54±4.53 73.61±6.83治療后32.58±2.17△28.42±3.06△37.83±4.62△50.18±5.03△

3.2 各組ROS、NO、SOD、TAC水平

表2顯示，G1組、G2組、G3組治療后與治療前比較精漿ROS、NO均有所降低，SOD、TAC水平有所提高，差異有統計學意義(P＜0.05);治療后G1組與G2、G3組比較差異有統計學意義，G1組為佳(P＜0.05)。

表2 各組精漿ROS、NO、SOD、TAC水平比較(±s)

表2 各組精漿ROS、NO、SOD、TAC水平比較(±s)

注:與治療前比較:△P＜0.05;與G2組比較:▲P＜0.05;與G3組比較:●P＜0.05

組別例數時間ROS(RLu/S)NO(μmol/L)SOD(U/ml)TAC(U/L) G1組33治療前38.15±1.02 78.95±3.01 8.36±4.02 24.65±0.25治療后25.23±2.21△▲●45.21±4.23△▲●12.28±0.38△▲●36.69±2.47△▲●G2組33治療前36.22±1.21 75.18±3.25 9.89±3.69 24.18±1.32治療后30.25±2.82△58.36±4.51△10.54±4.55△30.28±0.41△G3組33治療前38.63±2.36 74.85±3.11 8.19±4.26 24.54±0.99治療后29.65±2.53△49.22±4.01△10.48±4.87△31.56±0.45△

3.3 不良事件和不良反應

3組肝、腎功能均未見異常;血、尿、糞化驗正常;G3組有1例患者術后3 d出現術口紅腫，給予抗菌消炎及遠紅外燈治療后恢復正常。

3.4 隨訪

試驗結束后電話隨訪，未發現與藥物有關的嚴重不良反應。

3.5 脫落病例

所有患者都遵從要求完成試驗，未見脫落病例。

4 討論

中醫稱精索靜脈曲張癥為“筋瘤”“筋疝”或“偏墜”，是指精索蔓狀靜脈叢發生擴張、伸長及迂曲，原因可能是血管瓣膜功能不健全、靜脈回流受阻、血液返流、瘀滯等［5］。精索靜脈曲張為泌尿系統中的常見疾病，好發于左側，青壯年多見，且對睪丸的損害呈雙側性［6］。VC具有家族遺傳傾向性，發病率可隨年齡的增長而升高［7］。在男性不育癥的諸多因素中精索靜脈曲張是一種常見原因，特別是臨床III級曲張，常引起少精子、弱精子癥甚至睪丸萎縮。病理研究發現，精索靜脈曲張會導致睪丸中氧自由基濃度和一氧化氮(NO)濃度升高，腎臟及腎上腺毒素滯留;睪丸瘀血、缺氧引起睪丸微循環障礙［8］;干擾血清生殖激素的分泌，造成睪酮下降、泌乳素升高，從而導致精子生成與成熟障礙［9］。

氧化應激(Oxidativestress，OS)是指當氧化物含量超過抗氧化物含量，從而形成的過氧化產物增多引起的一系列病理現象。最新研究發現，精漿氧化應激水平與VC嚴重程度存在正相關［10］。精子在睪丸精曲小管生發與分化過程中需要保持氧化與抗氧化生理性平衡，而VC造成精漿氧化應激并打破了這種平衡。適當的氧化反應可清除睪丸中衰老、結構缺陷的精子細胞，對種族繁衍具有積極意義。但氧化應激則導致精子活力減弱、頂體反應受損、精子DNA損傷等，從而損害了男性的生殖能力。一氧化氮代謝紊亂和活性氧含量升高是2種常見的氧化應激病理機制。人類精漿存在一整套抗氧化防御機制，使精子免于氧化攻擊，保護精子的正常代謝，其中酶類抗氧化物如超氧化物歧化酶是重要的武器，如果抗氧化因子減少會促使氧化應激的發生。所以本課題引入ROS、NO、SOD作為重點觀測對象，并通過檢測精漿中總抗氧化能力來評價試驗效果。

精索靜脈高位結扎術是應用于治療VC的常用手段，Palomo術為改良型術式，療效得到一致肯定。但手術仍然具有一定風險，包括感染、出血過多、誤傷輸精管等，術后需要較長恢復時間，容易并發睪丸鞘膜積液、急性附睪炎、自身免疫性損傷等;加上患者對手術的顧慮使該方法應用受到限制［11］。探索中西醫結合方式，取長補短，既可以增加療效，又可以減少并發癥，或許是一種行之有效的途徑。

本試驗結果顯示，無論是單獨采用調肝活血湯、palomo手術治療還是調肝活血湯聯合palomo手術治療，患者精子密度都有所增加，提高了前向精子比例和精子活動率，精子畸形率有所減少，顯示3組治療方法都能改善患者的精液質量。經過統計發現，調肝活血湯聯合palomo手術組療效優于對照組;各組治療后精漿ROS、NO水平下降，說明該治療方案有效降低了睪丸中的氧化應激;SOD、TAC的增加，提示治療后患者精漿的抗氧化能力有所增強，生精上皮功能得到保護。同樣試驗組療效優于對照組，顯示了中西醫結合治療具有一定的優勢，比單純中藥治療或手術治療更能減輕氧化應激損傷。其原理可能有以下幾方面:一是緩解精索靜脈內血液瘀阻現象，降低睪丸溫度。本試驗用藥為清代名醫王清任的經典名方血府逐瘀湯為基本方加減而成，具有活血化瘀不傷血、疏肝解郁而不耗氣的特點，使得“肝脈條達，氣血平正”。加上手術改變了血流動力學，消除了返流，為精子生長與分化提供了較好的環境。二是應用中藥可加快術后精索靜脈側枝循環的建立，促進炎性物質的吸收與代謝，減輕了術后陰囊水腫以及自身免疫損傷等并發癥。三是應用活血化瘀中藥能改變血液高凝狀態，改善睪丸和附睪的微循環，防止性腺分泌管道阻塞，這是單獨手術所不能做到的。實驗證明，調肝活血湯聯合palomo手術法還可以緩解VC患者陰囊脹痛、潮濕等癥狀以及由此產生的焦慮、抑郁，是一種值得推廣的方法。而不足之處為研究時間有限，樣本量還不夠大，以后可以增加樣本含量，從多中心多靶點進一步深入研究分析。

［1］WHO.人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊［M］.4版.北京:科學技術出版社，2001:51.

［2］張元芳，孫穎浩，王忠.實用泌尿外科和男科學［M］.北京:科學出版社，2013:153.

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［11］吳階平.吳階平泌尿外科學［M］.濟南:山東科學技術出版社，2006:1945.

Observation of TiaoGanHuoXue Decoction Combined with Palomo Operation on the Oxidativestress in the Patients with Varicocele

GU Yu-neng1，CHEN Wei-tian1，WEN Zhi-Peng1△，ZENG Yang-lin2CHEN De-ning1
(1.Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenzhen 518033，Guangdong，China; 2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，Guangdong，China)

objective:To observe the efficacy of TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation on the oxidativestress in the patients with Varicocele Methods:Nighty-night patients with Infertility caused by varicocele were randomly divided into three groups.The G1treatment group treated with TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation.The G2control group treated with TiaoGanHuoXue decoction and the G3control group treated with Palomo operation.The therapeutic efficacy and the content of ROS、NO、SOD、TAC were evaluated after six months.Results:The treatment group showed a better effect than two control groups in improving sperm quality.The content of TAC and SOD was increased and the content of ROS and NO was decreased.Conclusion:TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation could improve the sperm quality for the patients with Oligoasthenozoospermia by improving oxidativestress.

TiaoGanHuoXue decoction;Palomo operation;Varicocele;Oxidativestress

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0651-04

2015-10-06

2012年深圳市科技計劃項目(201202156)-精索靜脈高位結扎術聯合調肝活血湯對VC患者精液質量的影響和精漿氧化應激干預的研究

古宇能(1979-)，男，廣東梅州人，副主任醫師，醫學碩士，從事泌尿男科的臨床與研究。

△

:溫志鵬，Tel:13713940819。