冠心病血瘀證的基因網絡模塊研究?

袁野，申春悌，胡鏡清

(1.南京中醫藥大學，南京210023;2.南京中醫藥大學附屬常州醫院，江蘇常州213000; 3.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京100700)

冠心病血瘀證的基因網絡模塊研究?

袁野1，申春悌2△，胡鏡清3

(1.南京中醫藥大學，南京210023;2.南京中醫藥大學附屬常州醫院，江蘇常州213000; 3.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京100700)

目的:探討冠心病血瘀證基因網絡中重要模塊的生物學功能與通路。方法:搜索文獻中冠心病血瘀證相關基因，并運用CYTOSCAPE進行網絡構建，MCODE進行模塊劃分后再對重要模塊進行功能與通路分析。結果:冠心病血瘀證網絡中BCL2、VEGFA、IL-6、JUN和IL-8具有重要作用。血管平滑肌增殖和toll樣受體信號通路分別是網絡中最重要的生物學過程與通路。結論:該研究既體現了冠心病血瘀證基因的整體特點，又關注了基因網絡的局部差異，為冠心病的預防與治療提供了新的思路。

冠心病;血瘀證;網絡;模塊

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，現代研究表明，本病的發生與血液黏度增高、血小板聚集增強致微循環障礙相關［1］。有研究證實，本病以活血化瘀藥治療具有較好的臨床療效［2-3］。冠心病中醫文獻中，血瘀證是其最常見的證型［4］。

目前已有較多對本病血瘀證的研究，如殷惠軍等研究發現，冠心病血瘀證差異基因IL-8具有激活血小板的作用［5］。毛以林等探討了ACE基因插入/缺失(insertion/deletion，I/D)多態性與冠心病血瘀證的關系［6］。這些研究關注了冠心病血瘀證患者單個或多個基因表達的上調或下降，探討了基因在疾病中的相關作用機制。但疾病的發生是整體的紊亂，是多個基因參與的多靶點、多通路的改變。2007年《新英格蘭醫學雜志》報道了與冠心病密切相關的幾個基因位點，在這幾個基因位點單獨或者聯合作用下，冠心病發病風險大為增加［7］。如何從諸多基因之間探索它們的聯系，網絡構建為我們提供了可行的方法。本研究在之前學者研究方法的基礎上，通過對文獻中冠心病血瘀證相關基因的分析及建模，進一步探索網絡中局部基因之間的聯系，力圖從現代科學的角度進一步挖掘證的實質。

1 文獻來源

1.1 文獻檢索方法

以“冠心病”、“血瘀證”、“基因”為關鍵詞，檢索CNKI、CBM、維普、萬方等中文數據庫，包含期刊和碩博論文。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準有明確的疾病和血瘀證診斷標準。

1.2.2 排除標準重復發表或數據不完整的文獻;會議摘要和評論及不能獲得完整數據的文獻。

2 研究方法

2.1 基因網絡分析

基因的網絡構建采用Agilent Literature Search。一款搜索文獻中與研究相關基因的軟件，并在搜索結果的基礎上構建相互聯系的網絡。通過Cytoscap插件可生成網絡概括圖。

2.2 模塊劃分

在構建冠心病相關網絡后，運用MCODE插件對網絡進行模塊劃分，以發現局部網絡中重要性及聯系更為密切的基因。MCODE最初是用來檢測PPI網絡中的蛋白質復合物的一種聚類算法，能夠在大規模的蛋白相互作用網絡里檢測出緊密連接的區域(即分子復合物)。現在該方法也可用于在其他類型的網絡中檢測出聚類，如基因的聚類［8］。

2.3 功能富集與通路查詢

在劃分模塊之后，本研究又對前三重要模塊的重疊基因進行了功能分析，采用DAVID 6.7(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov/)軟件對各組的模塊進行GO功能注釋和KEGG通路查詢。

3 結果

將119個基因導入Agilent Literature Search后，與冠心病血瘀證關系密切的另外493個基因被挖掘出，總共612個節點1834條邊構成了冠心病血瘀證的整體基因網絡。其中每個節點代表1個基因，邊的存在表明基因與基因之間具有關聯性。

將整體網絡分用MCODE進行模塊劃分，共有51個模塊，模塊的重要性根據模塊性(由節點數、邊數及介數中心性決定)排列，其中模塊1與模塊2的重要性明顯高于其他模塊。

模塊1共30個基因156條邊，BCL2、JUN、IL-6和VEGFA是擁有邊最多的基因(圖1)。模塊2共15個基因81條邊，IL-8、TNFA、MMP12是擁有邊最多的基因(圖2)。

表1顯示，對最重要的2個模塊進行富集分析與通路查詢，發現模塊1共有224個GO功能，10條KEGG通路;模塊2共有98個GO功能，4條KEGG通路。

表1 模塊1與模塊2中最有意義的生物學過程及通路。

圖1 M CODE最重要的模塊1

圖2 M CODE第二重要的模塊2

4 討論

網絡中的邊代表基因之間存在聯系，邊越多則聯系越廣泛，基因的重要性越強。MCODE模塊1中邊最多的4個基因是BCL2、VEGFA、IL-6和JUN，那么可以認為這4個基因在模塊1中對其生物學功能及通路具有重要影響。通過功能富集發現，模塊1最重要的生物學功能與通路分別是血管平滑肌增殖和toll樣受體信號通路。

之前Nair等研究了冠心病炎癥因子層面的整體關聯，從整體網絡中找到了重要的節點及生物學過程。發現白介素6(IL-6)、血管內皮生長因子A (VEGFA)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF)和前列腺素過氧化物合成酶2(PTGS2)是網絡的中心節點，其中白介素6具有最大的度及最高的介數中心性，JUN是最重要的調控網絡的轉錄因子。Smooth muscle cell proliferation(血管平滑肌增殖)，acute-phase response(急性階段反應)，calcidiol 1-monooxygenase activity(單氧化酶活性)是最重要的3個生物學過程。toll-like receptor signaling pathway(toll樣受體信號通路)，NOD-like receptor signaling pathway(NOD樣受體信號通路) and regulation of phosphorylation(調控磷酸化)是最重要的信號通路［9］。

本研究結果顯示，VEGFA、IL-6和JUN基因，血管平滑肌增殖過程及toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路同樣參與了冠心病血瘀證的病理過程，表明冠心病血瘀證與其炎癥反應存在一定的關系。

本研究顯示，血管平滑肌增殖是模塊1中最重要的生物學過程。血瘀證的治療大法以活血化瘀為主。目前已有許多研究表明，活血化瘀藥物可以改善冠心病心肌缺血狀態下血管平滑肌增殖的過程。劉擎發現，活血化瘀類中藥三棱的提取化合物SsnB作為一種新的選擇性toll樣受體2和toll樣受體4拮抗劑，可以減輕動脈粥樣硬化的形成與進展中的血管平滑肌細胞的增殖、遷移、炎癥反應［10］。研究發現，活血化瘀類中藥紅花和丹參均具有改善心肌供血、抑制血管平滑肌細胞增殖的藥理作用［11-12］。由丹參和紅花有效成分制成的丹紅注射液通過降低血漿內皮素(ET)水平，抑制血管平滑肌細胞增殖，從而達到抗動脈粥樣硬化的作用［13］。

同時4個重要基因也與平滑肌細胞增殖密切相關。Wang等發現，抑制平滑肌細胞的增殖可以提高動脈粥樣硬化斑塊的穩定性，這與減少炎癥因子TNF及IL-6表達相關［14］。Li等認為，CD59表達上調可以預防平滑肌細胞增殖對抗動脈粥樣硬化并促進BCL2的表達［15］。趙曙炎等發現，淫羊藿苷可以單獨或通過其代謝產物脫水淫羊藿素上調血管形成相關基因VEGFA、MMP-2和IL-8基因的表達，進而促進血管內皮細胞增生［16］。

研究發現，模塊1的toll樣受體信號通路與冠心病有較大聯系。Zhai等發現，toll樣受體4在心肌缺血再灌注的大鼠模型中調控炎癥反應，并參與逆轉心肌重塑的機制［17］。而具有益氣活血、化瘀通絡的銀丹心腦通，通過調控toll樣受體信號通路及降低IL-1β、IL-8、d IL-18等炎癥因子對抗心肌缺血再灌注的損傷［18］。目前的研究證實，基因BCL2、VEGFA、IL-6、JUN及平滑肌細胞增殖和toll樣受體信號通路參與了冠心病的疾病過程，但未有研究表明這些重要基因與該生物學過程、信號通路相互之間同時存在聯系。該研究表明，它們在冠心病血瘀證中的作用重要且聯系密切。

模塊2中邊最多的基因是IL8，最重要的生物學過程與通路分別是調控凋亡和NOD2信號通路。Han等發現，甘草查爾酮B在心臟缺血再灌注的過程中具有抗凋亡、抗炎的保護作用，可能與其降低IL-8的表達相關［19］。Stump f等認為，丹參用于冠心病患者時具有抗炎作用，這種作用可能與其顯著降低IL8、IL6在血管內皮細胞的表達相關［20］。IL6作為模塊1的重要基因同樣與模塊2的生物學過程相關。同樣MMP9也是模塊1的組成基因，與模塊2的重要通路相關。NOD2信號通路在心肌梗死中具有重要作用，它的減少可以對抗心肌梗死后的心臟重塑，其機制是減少了細胞因子、炎癥細胞浸潤及降低MMP9活性［21］。

IL6與IL8均為各自模塊的重要基因，但IL6所在模塊為冠心病中最重要的模塊，因此IL6在冠心病血瘀證中的作用更為關鍵。

隨著后基因組學時代的到來，與疾病相關的基因研究迅速涌現，因此從海量的文獻中挖掘出信息的關聯性也變得愈加復雜。網絡分析的方法幫助研究者對之前的研究進行了整體性回顧與串聯。值得肯定的是，該研究方法既體現了冠心病血瘀證基因的整體特點，又關注了基因網絡的局部差異。模塊與模塊之間并不是孤立的，其構成的基礎是在整體網絡關聯的情況下，內部的聯系更為密切。如IL6和IL8它們是各自模塊的重要組成基因，具有最多的邊，同時又有邊聯系于其他模塊，并與外部模塊的通路、基因或功能相關聯。

該研究找到了冠心病血瘀證最重要的基因模塊及其中的重要基因，若能在此基礎上探索有效的同時干預這幾個重要靶基因的方藥，則可為疾病的診斷與治療提供新的思路。

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Study on Genetic Network Module of Blood Stasis Syndrome of Coronary Heart Disease

YUAN Ye1，SHEN Chun-ti2△，HU Jing-Qing3
(1.Nanjing university of Chinese medicine，Nanjing 210023，China; 2.Changzhou hospital affiliated to Nanjing university of Chinese medicine，Changzhou 213000，China; 3.Basic Theory Institute of Chinese Medicine，CACMS，Beijing 100700，China)

Objective: Blood stasis is the predominant syndrome of coronary heart disease(CHD) ，however，there still lack of a genetic landscape of it．We are aiming to explore the biological processes and pathways of blood stasis of coronary heart disease．Methods: We obtained genes from the literatures and applied Agilent Literature Search for network construction，MCODE for modularized analysis．After that，a functional enrichment analysis was performed to find the biological processes and pathways of the most important modules．Results: 119 Blood stasis-related genes were found from the literatures and were used to mining more potential related genes．Totally，other 489 genes were found correlated to the blood stasis of CHD，612 nodes and 1834 edges consist of the whole network．Each node represents one gene，and edge means there is connection between the genes．Bcl2、VEGFA、IL-6、IL-8 and JUN play important roles in the network for they owning the most edges．Regulation of smooth muscle cell proliferation is the most important biological process of the significant module，toll-like receptor signaling is the most important pathway of it．Conclusion: Our findings are considerably in accord with previous research show that network analysis is an useful and stable tool．It allowed us to gain a better understanding of the pathological mechanism of the blood stasis of CHD．

Coronary Heart Disease;Blood Stasis;Netwok;Module

R541.4

:A

:1006-3250(2016)05-0642-03

2015-11-14

973課題“基于冠心病痰瘀互結證辨證方法的創新研究”(2014CB542903)

袁野(1987-)，男，江蘇南京人，醫學博士，從事從事中醫證候研究。

△通訊作者:申春悌(1949-)，女，江蘇常州人，醫學學士，博士研究生導師，從事中醫證候的臨床與研究，Tel: 13906126896，E-mail:czsct@163.com。