模擬腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型中GDF-9、BMPR-2的表達研究?

鄧蒂斯，徐曉娟，姚莉娟，王張，黃立華，李宛靜，何蘊良

(成都中醫藥大學，成都610075)

模擬腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型中GDF-9、BMPR-2的表達研究?

鄧蒂斯，徐曉娟△，姚莉娟，王張，黃立華，李宛靜，何蘊良

(成都中醫藥大學，成都610075)

目的:探討生長分化因子-9(GDF-9)及骨形態發生蛋白受體-2(BMPR-2)在有腎虛痰濕特征信息的肥胖多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠模型的卵巢顆粒細胞中的表達。方法:分別在來曲唑(Letrozole)和脫氫表雄酮(DHEA)造?；A上加用高脂乳劑，建立肥胖PCOS動物模型，結合陰道脫落細胞涂片、大鼠體質量增加幅度、血脂水平和卵巢形態學的改變進行模型驗證，選用免疫組化法檢測大鼠模型卵巢組織卵泡顆粒細胞中GDF-9、BMPR-2的表達。結果:模型建立成功，Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組GDP-9積分光密度總和均顯著低于高脂模型組。此外，Letrozole肥胖模型組GDP-9平均灰度均值低于高脂模型組，DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9積分光密度總和均顯著高于空白對照組，Letrozole模型組BMPR-2積分光密度總和均顯著高于高脂模型組，DHEA模型組BMPR-2積分光密度總和顯著高于高脂模型組。結論:推測GDF-9、BMPR-2在肥胖PCOS大鼠模型卵巢的卵泡顆粒細胞中表達降低可能是肥胖PCOS發生發展的重要原因。

生長分化因子-9;骨形態發生蛋白受體-2;腎虛痰濕特征信息;肥胖PCOS大鼠模型;顆粒細胞

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome， PCOS)是涉及多器官、多系統的以排卵障礙、高雄激素血癥和(或)胰島素抵抗(IR)為特征的內分泌紊亂性疾病，臨床表現可見高度多樣化，其病理機制尚無定論［1］。李琴華等［2］指出，38%～88%的PCOS患者都伴有體質量超標或肥胖，肥胖型PCOS患者伴有代謝綜合征的風險明顯高于非肥胖型PCOS患者。最近研究表明，卵巢病理改變的重要原因是卵巢局部微環境紊亂和細胞因子表達及功能異常，卵母細胞分泌的生長分化因子-9(GDF-9)與卵泡生長發育密切相關，推測GDF-9表達發生變化也許是導致本病患者卵泡發育異常的原因之一［3-4］。骨形態發生蛋白受體-2(BMPR-2)主要表達于顆粒細胞和卵泡膜細胞，主要通過與GDF-9結合起作用［5］。GDF-9和BMPR-2都是卵泡生長發育和卵巢功能的重要調節因子，均經由自分泌和旁分泌機制對卵巢局部細胞的分化、增殖和其他功能進行調節，從而達到對優勢卵泡形成和卵母細胞成熟的調控［6-7］。本研究系對GDF-9和BMPR-2在肥胖PCOS動物模型卵丘顆粒細胞的蛋白表達進行探索性研究，旨在探討卵源性因子在PCOS卵泡發育異常機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

6周齡清潔級SD雌性大鼠36只，體質量100～120 g，購于成都達碩生物科技有限公司(生產許可證號SCXK(川)2013-24，生產批號0018284)。飼養條件:環境溫度為20℃～24℃，濕度40%～70%，每天陽光下照射10 h，自由飲水，進食顆粒飼料。來曲唑(Letrozole)購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(生產批號14030657)，脫氫表雄酮(DHEA)購于美國IL公司，注射用油購于天津市北辰方正試劑廠(生產批號201407)，膽固醇購自河南興源化工產品有限公司(20140524)。兔抗鼠GDP-9多克隆抗體(BA1288，生產批號59000)和兔抗鼠BMPR-2多克隆抗體(BA2820-1，生產批號D-B1-08E07A)購于博士德生物有限公司。

1.2 分組與建立改良PCOS動物模型采用隨機數字表法將大鼠分為空白對照組、高脂模型組、Letrozole模型組、Letrozole聯合高脂模型組(簡稱Letrozole肥胖模型組)、DHEA模型組和DHEA聯合高脂模型組(簡稱DHEA肥胖模型組)6組各6只，分籠喂養。造模方法:空白對照組大鼠行頸部皮下注射生理鹽水0.2 ml，同時灌胃濃度10 mg/ml的羧甲基纖維素溶液(CMC)13 ml/kg·d;高脂模型組大鼠灌胃高脂乳劑(豬油+膽固醇，豬油∶膽固醇=10∶3)15 ml/kg·d;Letrozole模型組大鼠灌胃Letrozole1 ml/kg·d;Letrozole肥胖模型組大鼠灌胃Letrozole1 ml/kg·d及灌胃高脂乳劑15 ml/kg·d;DHEA模型組大鼠皮下注射DHEA 60 ml/kg·d;DHEA肥胖模型組大鼠皮下注射DHEA 60 ml/kg·d及灌胃高脂乳劑15 ml/kg·d。連續21 d于早上9時開始造模處理。

1.3 大鼠動情周期檢測

自造模處理第10天起，各組每天開始進行陰道涂片，用生理鹽水浸泡消毒棉拭子放入大鼠陰道逆時針旋轉，取出后涂片。涂片自然風干后行巴氏染色法染色。鏡下連續觀察動情周期的變化2個周期，1個動情周期為5 d。

1.4 卵巢標本處理

造模處理第22天以苯巴比妥鈉麻醉大鼠。取出雙側卵巢，左側用福爾馬林、醋酸、酒精固定液(FAA)固定48 h，逐級酒精脫水，后用二甲苯透明、浸臘，以卵巢最大平面為待測面，常規石蠟包埋，制成4 μm厚切片，在Mias-2000圖形分析系統(四川大學圖像圖形研究所)下定量觀察。將右側卵巢迅速置入－80℃保存。

1.5 體質量與血脂檢測

測量體質量，股動脈取血分離血清。采用全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)后，頸椎脫臼處死大鼠。

1.6 免疫組織化學檢測

將左側卵巢冷藏后進行石蠟切片脫蠟至水。室溫條件下孵育10 min，去除內源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。用PBS稀釋的10%正常山羊血清封閉，室溫條件下孵育10 min。傾去血清，滴加稀釋的一抗(稀釋倍數1∶100)，4℃過夜。PBS沖洗3×5 min，滴加生物素標記的二抗工作液，室溫30 min，PBS3×5 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS 3×5 min，DAB顯色。自來水充分沖洗、復染、封片。一抗由PBS代替為陰性對照，卵巢組織顆粒細胞呈現棕黃色顆粒為陽性信號。每張切片隨機選定5個區域，分別測定陽性細胞的平均灰度，再取平均值分別反映該卵巢組織中GDF-9和BMPR-2蛋白質表達水平。取10ul PCR產物，用2%瓊脂糖凝膠行電泳，應用凝膠圖像分析處理系統掃描并計算積分光密度。

1.7 統計學方法

采用PEMS 3.1統計軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動情周期變化

表1顯示，空白對照組大鼠陰道涂片均保持規律的4 d動情周期的變化。高脂模型組大鼠陰道涂片示動情前期、動情期及間期交替出現。Letrozole模型組大鼠動情周期紊亂，陰道涂片示持續4 d處于動情間期。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組大鼠失去正常動情周期，陰道涂片示持續處于動情前期和動情期。

2.2 體質量增長幅度變化

表2顯示，高脂模型組大鼠的體質量增長幅度顯著高于空白對照組(P＜0.05)。Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組和DHEA肥胖模型組大鼠的體質量增長幅度均極顯著高于空白對照組和高脂模型組(P＜0.01)。Letrozole模型組的體質量增長幅度低于Letrozole肥胖模型組大鼠，DHEA模型組大鼠的體質量增長幅度低于DHEA肥胖模型組，差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 大鼠動情周期及排卵情況

2.3 血脂水平

表2顯示，Letrozole肥胖模型組大鼠的TC極顯著高于空白對照組、高脂模型組和Letrozole模型組(P＜0.01)。Letrozole模型組大鼠的TG顯著高于空白對照組。Letrozole肥胖模型組大鼠的TG顯著高于空白對照組、高脂模型組和Letrozole模型組(P＜0.05)。DHEA模型組TC、TG顯著高于空白對照組(P＜0.01)。DHEA肥胖模型組大鼠的TC極顯著高于空白對照組、高脂模型組和DHEA模型組(P＜0.01)。DHEA肥胖模型組大鼠的TG極顯著高于空白對照組，高于高脂模型組和DHEA模型組(P＜0.05)。

表2 大鼠體質量增加幅度和血脂水平表(±s)

表2 大鼠體質量增加幅度和血脂水平表(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與Letrozole模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與DHEA模型組比較:#P＜0.05

組別鼠數體質量增加幅度(g)TC(mmol/L)TG(mmol/L) 54.12±10.23 1.42±0.22 0.75±0.19高脂模型組6 67.87±9.71*1.54±0.14 0.81±0.10 Letrozole模型組6 83.45±9.65＊＊△△1.63±0.18 0.98±0.15＊＊Letrozole肥胖模型組6 85.78±11.86＊＊△△2.01±0.23＊＊△△▲▲1.09±0.09＊△▲DHEA模型組6 80.42±9.80＊＊△△1.91±0.10＊＊0.93±0.08＊＊DHEA肥胖模型組6 82.59±9.73＊＊△△2.31±0.31＊＊△△▲▲1.05±0.17＊＊△#空白對照組6

2.4 卵巢HE染色

空白對照組大鼠卵巢表面較紅，HE染色后在光鏡下觀察到發育時期各不相同的初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、黃體和白體。其余各造模組大鼠卵巢表面蒼白，HE染色后在光鏡下觀察，高脂模型組大鼠可見閉鎖卵泡和囊狀卵泡數量增多，同時可見少量的黃體和白體。Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組、DHEA肥胖模型組分別行HE染色法，光鏡下大鼠卵巢的次級卵泡數量減少，而囊狀卵泡和閉鎖卵泡增多，未見排卵前的成熟卵泡，同時可見黃體和白體明顯減少。

2.5 GDF-9及BMPR-2在PCOS卵巢中表達

圖1、2顯示，GDF-9免疫組化法檢測顯示，空白對照組大鼠卵巢結構完整，正常的初級卵泡、次級卵泡是GDF-9主要表達的部位。其余各模型組卵巢組織結構紊亂，可見大量閉鎖卵泡及囊狀擴張的卵泡，在顆粒細胞層中可見少許GDF-9分布。BMPR-2免疫組化法檢測顯示，空白對照組BMPR-2主要表達于發育正常的始基卵泡、初級卵泡和小竇卵泡中。其余各模型組BMPR-2在始基卵泡、初級卵泡表達降低，同樣在小竇卵泡達到較高水平。

圖1 卵巢組織GDF-9蛋白的免疫組織化學染色結果(×100)

Letrozole模型組和Letrozole肥胖模型組GDF-9積分光密度總和顯著低于高脂模型組(P＜0.05)。Letrozole肥胖模型組GDF-9平均灰度均值均低于高脂模型組(P＜0.05)。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9積分光密度總和顯著高于空白對照組(P＜0.05)。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9平均灰度均值低于空白對照組和高脂模型組，差異無統計學意義(P＞0.05)。Letrozole造模法可致肥胖PCOS大鼠積分光密度總和降低，DHEA造模法則發現肥胖PCOS大鼠積分光密度總和升高。然而所有的PCOS大鼠平均灰度均值均降低，表明GDF-9在肥胖PCOS動物模型中的表達降低。Letrozole模型組BMPR-2積分光密度總和顯著高于高脂模型組(P＜0.05)。Letrozole模型組和Letrozole肥胖模型組BMPR-2平均灰度均值低于空白對照組和高脂模型組，差異無統計學意義(P＞0.05)。DHEA模型組BMPR-2積分光密度總和顯著高于高脂模型組(P＜0.05)。DHEA模型組和DHEA肥胖模型組BMPR-2平均灰度均值均低于空白對照組和高脂模型組，差異無統計學意義(P＞0.05)。Letrozole造模法、DHEA造模法可致PCOS大鼠積分光密度總和升高，平均灰度均值均降低，表明BMPR-2在PCOS動物模型中表達降低。

圖2 卵巢組織BM PR-2蛋白的免疫組織化學染色結果(×100)

表3 GDF-9及BM PR-2在肥胖PCOS動物模型中的表達(±s)

表3 GDF-9及BM PR-2在肥胖PCOS動物模型中的表達(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05;與高脂模型組比較:△P＜0.05

組GDF-9 BMPR-2別鼠數積分光密度總和平均灰度均值積分光密度總和平均灰度均值空白對照組6 15558.84±3119.70 116.68±8.06 18997.81±26 114.99±6.25 26816.42±8641.28 101.93±7.91 28.27 108.31±4.25高脂模型組6 18085.17±4407.14 116.55±3.40 14645.58±4019.42 106.93±3.49 Letrozole模型組6 12721.82±3980.68△110.73±3.98 22687.59±5037.26△102.41±7.55 Letrozole肥胖模型組6 12577.38±2154.50△109.06±3.10△18510.97±5097.50 105.69±3.73 DHEA模型組6 23586.88±5446.42*113.67±4.70 31012.49±16751.53△105.56±10.86 DHEA肥胖模型組6 21332.98±4380.13*

3 討論

課題組前期研究發現，DHEA造模、芳香化酶抑制劑造模均可出現體質量增加，卵巢質量、卵巢體積增加，促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮升高，胰島素抵抗及卵巢呈現多囊樣改變。DHEA造模卵巢無論是組織形態學還是激素水平的變化，均與PCOS患者接近。但由于介入外源性的雄激素，為排除外源性雄激素造成的干擾，故造模時同時采用芳香化酶抑制劑。芳香化酶抑制劑所造腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型與人類疾病相似，可作為DHEA造模的對比。本研究加用高脂乳劑造模大鼠模擬前述近似腎虛痰濕證型患者的多項特征生化信息，此改良造模方法在課題組前期研究中已有論述［8］。Letrozole肥胖模型組大鼠的體質量增加幅度高于Letrozole模型組，TC及TG極顯著高于空白對照組、高脂模型組和Letrozole模型組。DHEA肥胖模型組大鼠的TC及TG極顯著高于空白對照組、高脂模型組和DHEA模型組。大鼠處死時體質量增加幅度明顯升高，血脂TC、TG增高，成功建立肥胖PCOS模型。PCOS的病理特點為卵泡發育過程中卵泡募集亢進，優勢化選擇受阻和卵泡閉鎖退化失調，造成小卵泡的集聚，無優勢卵泡形成。卵母細胞和卵泡發生是一個協同過程，卵母細胞的生長和卵泡發育與卵母細胞和體細胞的相互交流有著重要的聯系。研究表明，卵母細胞分泌的GDF-9和BMPR-2對調節卵巢功能、卵泡發育過程中卵泡膜細胞增殖與分化具有重要作用，推測GDF-9參與了肥胖PCOS發病的病理生理過程。由卵子分泌的GDF-9和BMPR-2可直接調節顆粒細胞的增生、分化、代謝、黃素化和凋亡，顆粒細胞的分泌信號也通過顆粒細胞間的縫隙連接調節卵子的生長和發育［9-10］。

本研究結果表明，Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組和DHEA肥胖模型組GDF-9表達降低，可以推測GDF-9在腎虛痰濕特征信息PCOS大鼠模型的卵巢卵泡顆粒細胞中表達的降低，可能是影響卵母細胞形成及質量的原因之一，而卵巢發育的異常又會影響GDF-9的分泌，從而形成惡性循環。Letrozole模型組、Letrozole肥胖模型組、DHEA模型組和DHEA肥胖模型組BMPR-2平均灰度均值均低于空白對照組。BMPR-2表達水平的降低也可能是影響卵母細胞形成及質量的原因之一，GDF-9與BMPR-2結合才能發揮作用，BMPR-2表達的降低將進一步導致GDF-9信號通路異常，從而影響卵母細胞的形成及質量。有臨床研究也顯示，PCOS不排卵患者GDF-9 mRNA的表達降低并延遲［11］。

綜上所述，具有近似中醫臨床腎虛痰濕證型特征信息的肥胖PCOS動物模型顆粒細胞中GDF-9、BMP-2蛋白表達水平低下可能影響卵母細胞質量，形成大量的閉鎖卵泡和囊狀卵泡，無排卵前的成熟卵泡，最終導致肥胖PCOS形成。因此對GDF-9和BMPR-2的深入研究，對治療腎虛痰濕證肥胖型PCOS具有臨床指導意義，二者之間的相互作用尚有待進一步的研究。

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Expression Research on GDF-9，BMPR-2 in the PCOS Rat Models Simulate the Feature Information of Kidney Deficiency and Phlegm-dampness Stagnation

DENG Di-si，XU Xiao-juan△，YAO Li-juan，WANG Zhang，HUANG Li-hua，LI Wang-jing，HE Yun-liang
(Chengdu University of Chinese Medicine，Chengdu 610075，China)

Objective: To study the expression of Growth differentiation factor 9 (GDF-9) and Bone morphogenetic protein receptor type 2 (BMPR-2) in the ovarian granular cells of the obese Polycystic Ovary Syndrome(PCOS) rat models which has the characteristics of the deficiency of kidney and the stagnation of phlegm-dampness．Method: The obesity PCOS rat models were built respectively with high fat emulsion on the basis of Letrozole and DHEA(Dehydroepiandrosterone) models．The models were verified by the smears of vaginal exfoliated cells，the weight growth rate when rats were killed，the lipid levels and the morphological changes of ovarian．Immunohistochemical method was chosen to detect the expression of GDF-2，BMPR-2 in the ovarian tissue granulosa cells of rat models．Results: Models were set up successfully．The GDP-9 integral optical density in Letrozole group and Letrozole obese group were both significantly lower than high fat emulsion group．Besides，the GDP-9 average grayscale valuein Letrozole obese group was lower than high fat emulsion group; the GDP-9 integral optical density in DHEA group and DHEA obese group were significantly higher than the blank control group; the BMPR-2 integral optical density in Letrozole group was significantly higher than high fat emulsion group; the BMPR-2integral optical density in DHEA group was significantly higher than high fat emulsion group，the differences were statistically significant．Conclusion: It can be inferred that the expression of GDF-9 and BMPR-2 reduced in the ovarian follicle granulosa cells of the obese PCOS rat models were likely to be the important reasons for occurrence and development of the obese PCOS．

GDF-9;BMPR-2;Characteristics Of the Deficiency of Kidney And the Stagnation Of Phlegm-dampness; the Obese PCOS Rat Model;Granular Cells

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0621-05

2015-09-14

國家自然科學基金資助項目(81470199)-經APN信號通路探討補腎化痰法調控肥胖型PCOS卵泡發育機制研究;成都中醫藥大學科技發展基金項目(ZRMS201307)-PCOS動物模型中腎虛痰濕型診斷要素的信息挖掘研究

鄧蒂斯(1990-)，女，四川成都人，在讀碩士，從事中藥對女性生殖內分泌調控的臨床與研究。

△通訊作者:徐曉娟(1969-)，女，江蘇鎮江人，副研究員，醫學博士，碩士研究生導師，從事補腎中藥對女性生殖內分泌調控的臨床與研究，Tel:13980971928，E-mail:847956379@ qq.com。