高遷移率族核小體結合蛋白家族的研究進展

李晶，楊帆，魏楓，任秀寶（1天津醫科大學腫瘤醫院，天津300060；2國家腫瘤臨床醫學研究中心；3天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室）

高遷移率族核小體結合蛋白家族的研究進展

李晶1，2，3，楊帆1，2，3，魏楓2，3，任秀寶1，2，3
（1天津醫科大學腫瘤醫院，天津300060；2國家腫瘤臨床醫學研究中心；3天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室）

高遷移率族核小體結合蛋白（HMGN）是一類幾乎存在于所有哺乳動物和多數脊椎動物的細胞核中的非組蛋白，在活細胞內能通過與核小體結合來調節基因表達，以其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移率而得名。諸多研究證實，HMGN是與包括腫瘤在內的多種疾病發生密切相關的調控因子。HMGN家族包含五種染色體結構蛋白，即HMGN1～HMGN5，各成員作為細胞內的染色質結合蛋白，參與DNA復制與表達、細胞分化、器官發育及基因表達調控等多種細胞的生命活動。HMGN1、HMGN2通過調節某些基因或蛋白表達來影響器官發育成熟，同時還參與腫瘤免疫反應。HMGN3與人2型糖尿病的發生及肝癌化療耐藥有關。目前對HMGN4的研究相對較少。HMGN5過表達是腫瘤浸潤和轉移的一個重要因素。近年來關于HMGN1、HMGN2、HMGN5在腫瘤治療方面的研究不斷增多，但均停滯于臨床前期階段。

高遷移率族核小體結合蛋白；腫瘤；DNA復制

疾病的發生是遺傳、病理、環境等多因素長期作用的結果，其中包含基因表達改變、細胞分化異常、凋亡及代謝紊亂等一系列病理變化過程。HMGN家族包含五種染色體結構蛋白，即HMGN1～HMGN5，他們表達于脊椎動物細胞內，具有組織特異性。HMGN家族各成員均包含一個雙向核定位信號（NLS）、一個高度保守的核結合區域（NBD）及一個帶負電荷的調節區域（RD）。HMGN與核小體的結合不具有序列特異性，而是由其自身NBD調控。HMGN與染色體不同結合位點的核小體瞬時結合，改變染色體的結構，進而調節其活性，影響基因表達、器官分化等生物學過程?，F就HMGN家族的研究進展綜述如下。

1 HMGN1

1.1 概述 HMGN1（原名HMG14）最初由Graham等于1977年從豬胸腺中提取出來。接著Johns等又從雞紅細胞核中分離出HMGN1。人的HMGN1蛋白由100個氨基酸組成，大小約10.6 kD，其編碼基因位于人染色體21p22和鼠16號染色體。HMGN1除了能與DNA結合并影響其復制和轉錄外，亦在DNA損傷修復、器官分化發育、疾病的發生等過程中發揮作用。

1.2 HMGN1調節基因表達 HMGN1能與核小體結合從而調節基因表達。Rubinstein等［1］比較了HMGN1敲除小鼠與野生型小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）DNA微陣列，結果HMGN1敲除小鼠MEFs 中N-鈣黏蛋白的水平較野生型小鼠增加了4倍。這說明HMGN1能負向調節N-鈣黏蛋白的表達，在小鼠發育過程中，HMGN1可能通過與染色質相互作用使MEFs中N-鈣黏蛋白表達降低。對HMGN1敲除小鼠的基因表達分析顯示上皮特征性標記--谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）4和GST 1明顯減少，而黏附分子——E-鈣黏蛋白、α-，β-，γ-連環蛋白則顯著增加。免疫熒光標記發現野生型小鼠角膜基底層有HMGN1和p63共定位區域，而HMGN1敲除小鼠角膜細胞則不表達p63蛋白。據此推測，HMGN1可能與染色體相互作用，調節包括p63在內的部分基因表達，進而影響角膜的形成及成熟。

1.3 HMGN1參與器官發育 將小鼠HMGN1基因敲除后會出現角膜上皮變薄、角膜細胞減少、基底細胞減少、表皮細胞濾泡化等角膜上皮成熟障礙的現象。胚胎枝芽形成微團培養實驗證實HMGN1表達減少能促進軟骨細胞分化。實驗證實，HMGN1是通過與Sox9基因相互作用來抑制軟骨發育的。因此，HMGN1在器官分化發育中的作用不可小覷。

1.4 HMGN1參與DNA損傷修復 染色質在損傷后出現一系列的動力學變化并修復DNA。紫外線暴露（UV）研究［2］和電離輻射（IR）敏感性實驗［3］證明HMGN1能通過與染色質結合并調節其功能進而增強照射后細胞的存活能力。UV和IR照射致DNA損傷后，細胞或組織的反應與毛細血管擴張性共濟失調癥突變基因（ATM）激酶的激活狀態有關。進一步研究發現HMGN1影響ATM激酶與染色質間的相互作用，而這作用在ATM激酶激活中非常重要。最近研究還發現，HMGN1能與增殖細胞核抗原（PCNA）結合并促進PCNA與染色質的結合［4］。在細胞周期的各個階段，PCNA均能迅速聚集到DNA損傷區域并與染色質緊密結合，促進DNA修復。因此，HMGN1通過作用于PCNA從而增強DNA的修復能力，在一定程度上減少了由DNA損傷引起的疾病發生。

1.5 HMGN1參與唐氏綜合癥（DS）發生 DS是首個發現由染色體缺陷造成的人類疾病，主要表現為學習障礙、智力障礙等神經發育異常癥狀。1959年法國遺傳學家杰羅姆.勒瓊發現該病是由人體的第21對染色體的三體變異造成。研究［5］發現，HMGN1可能通過調節甲基CpG結合蛋白2 （MeCP2）表達，進而導致神經發育的異常。與正常樣本相比，DS樣本中HMGN1上調了2倍［6］。這說明HMGN1可能參與了DS的發生。據報道，DS患兒患急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）的風險平均比普通人高20倍［7］，且最新研究［8］亦證實HMGN1過表達和染色體甲基化改變是DS相關B-ALL的主要機制。因此，HMGN1可能在DS及其相關B-ALL的發生發展中起作用。

1.6 HMGN1促進腫瘤特異性免疫反應 警報素是一類具有募集和活化樹突狀細胞（DC）雙重作用的內源性分子，能增強抗原特異性的免疫反應。最近發現HMGN1作為一種警報素在腫瘤治療中發揮重要作用。Yang等［9］用脂多糖免疫刺激小鼠，結果HMGN1敲除小鼠產生的抗原特異性抗體和T細胞反應明顯弱于野生型對照組，這主要源于免疫區DC細胞聚集減少和炎癥細胞因子產生不足。此外，HMGN1可與DC細胞膜上的Toll樣受體4（TLR4）結合，進而激活DC細胞內NF-κB信號通路和多個絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路［9］。結果使免疫區聚集的DC細胞表面共刺激分子和MHC分子的表達上調，促炎細胞因子（如TNF-α、IL-12p70和IL-1）分泌增多。HMGN1可促使INF-γ分泌增多，而對IL-4無影響，說明HMGN1能促進Th1型免疫反應［9］。

魏楓等［10］將帶有腫瘤相關抗原（TAA）卵清蛋白（OVA）的EG7胸腺癌細胞注入小鼠皮下，結果HMGN1敲除小鼠的皮下腫瘤細胞生長速度明顯較同窩HMGN1未敲除小鼠快。四聚體染色及流式細胞術分析接種EG7細胞后小鼠的脾淋巴細胞，提示野生型小鼠產生的OVA特異性CD8+細胞比HMGN1敲除小鼠多。說明HMGN1能促進腫瘤特異性免疫反應。將不表達OVA的EL4細胞種植于C57BL/6小鼠發現，分泌型表達HMGN1的EL4細胞形成腫瘤較野生型EL4細胞慢。說明在無TAA刺激的情況下HMGN1亦能發揮抗腫瘤作用，即促進固有免疫應答抵抗腫瘤。該研究組將編碼HMGN1、gp100或HMGN1-gp100融合蛋白的基因分別與胰島素信號肽重組構建重組質粒，即pcDNA3. 1-gp100、pcDNA3.1-HMGN1和pcDNA3.1-HMGN1-gp100［10］。用這些質粒接種于C57BL/6小鼠后，結果顯示，注射pcDNA3.1-HMGN1-gp100疫苗的小鼠腹股溝淋巴結和脾臟內產生的IFN-γ+CD8T細胞比對照組（接種pcDNA3.1、pcDNA3.1-gp100，pcDNA3.1-HMGN1質粒的小鼠）多。在接種小鼠的皮下種植B16F1黑色素瘤，結果與對照組（接種質粒pcDNA-gp100、pcDNA-HMGN1或兩者混合的小鼠）相比，接種pcDNA3.1-HMGN1-gp100小鼠皮下未形成明顯的腫瘤，且其產生的保護性抗腫瘤作用更強［10］。據此，HMGN1可能具有抑制腫瘤的作用，并有望成為抗腫瘤疫苗治療腫瘤的佐劑。

2 HMGN2

2.1 概述 HMGN2是HMGN家族的又一亞型，是最保守的一員，其相對分子質量約為9.2 kD，共由90個氨基酸殘基組成。HMGN2編碼基因位于人染色體1p36和鼠4號染色體［11］，最早從雞紅細胞核中提取出。實驗證明，HMGN2具有改變染色體活性、參與器官分化發育、調節DNA損傷修復等多方面功能。

2.2 HMGN2參與器官發育 最近研究表明，HMGN2不僅能在胚胎動物模型中抑制紅系分化和骨細胞形成，同時能阻礙紅白血病細胞向紅系分化［12］。體外軟骨形成微團培養實驗還發現，HMGN1表達減少反而會增加HMGN2與Sox9結合。據此可推測，HMGN2可能在胚胎形成過程中參與了細胞分化。

2.3 HMGN2參與DNA損傷修復 HMGN2能與核小體結合改變染色體結構參與DNA損傷修復過程。Subramanian等用不同強度紫外線分別照射野生型和突變型DT40細胞系，結果發現敲除HMGN2使DT40細胞對紫外線敏感性增加。此外，研究者還用環丁烷嘧啶二聚體（CPD）--細胞內DNA受紫外線照射后的產物，作為DNA修復的評價指標，分別在紫外線照射后檢測細胞內CPD的修復情況。結果顯示，在不同時間點野生型DT40細胞CPD均較HMGN2失效突變細胞CPD修復比例高。該實驗證明HMGN2能促進UV照射后損傷DNA的修復。HMGN2通過其C端與核小體組蛋白H1作用來實現與DNA結合［13］。然而，Wu等［14］證明，在E3連接酶調節下，HMGN2與泛素相關調節劑1（SUMO1）的共價結合可使HMGN2與染色質核中心體的結合能力下降。HMGN2基因染色體定位靠近某些抑癌基因，故其還可能會參與腫瘤相關基因表達的調控。

2.4 HMGN2發揮抗菌活性 實驗證明，HMGN2重組蛋白具有抑制大腸桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌等作用。其發揮抗菌作用的主要結構可能是位于其蛋白分子18到48的一段螺旋序列。Wu等［15］用不同濃度HMGN2處理后的肺炎克雷伯桿菌03183菌株感染膀胱上皮細胞T24，結果發現與對照組相比用128 g/mL的HMGN2處理后菌株進入T24細胞的能力較弱。原因可能是HMGN2減弱了菌株黏附膀胱上皮的能力及T24細胞胞外信號調節酶的磷酸化。

2.5 HMGN2參與腫瘤免疫 Su等［16］用IL-2和植物血凝素（PHA）刺激外周血單核細胞（PBMCs），結果從這些細胞上清中分離出HMGN2。HMGN2主要由激活的CD8+T細胞分泌。提取并培養PBMCs，從中分離CD8+T細胞，用PHA或腫瘤抗原分別刺激體外分離的PBMCs和CD8+T細胞，接著分析HMGN2的表達及釋放水平，發現刺激后CD8+T細胞高表達HMGN2蛋白，同時細胞上清具有抗腫瘤的作用，且這種抗腫瘤活性能被抗HMGN2抗體抑制，這說明HMGN2是激活后細胞上清中發揮抗瘤活性的主要成分之一。體外實驗發現，接受HMGN2蛋白處理后的口腔鱗癌細胞［17］及HMGN2過表達的骨肉瘤細胞［18］均表現出生長抑制和細胞周期停滯。這一結果在活體腫瘤模型中亦得到驗證［17，18］。

3 HMGN3

HMGN3的結構高度保守，包含兩個剪接變異體，即HMGN3a和HMGN3b。HMGN3a具有經典的HMGN區域（HLS、NBD和RD），而HMGN3b缺少RD區域［11］。酵母雙雜交實驗發現Hela細胞中HMGN3可能通過與荷爾蒙受體結合來促進受體與染色體的相互作用。在胚胎發育的不同時期，HMGN3在眼不同部位中的含量不同，提示其可能參與小鼠眼球的發育成熟。

Barkess等［19］發現，HMGN3a/b與染色體結合使H3K14乙?；M一步刺激Glyt1基因表達。HMGN3協同轉錄因子PDX-1與葡萄糖轉運基因Glut2啟動子結合，從而促進Glut2表達。HMGN3敲除后小鼠接受糖刺激后的胰島素分泌量較對照組少，而胰島素分泌量不足又是2型糖尿病的重要發病機制，因此，HMGN3可能與2型糖尿病的發生密切相關。HMGN3廣泛分布于胰腺所有內分泌胰島細胞核內，不僅能調節胰島素的分泌，且在胰高血糖素的分泌調節中發揮作用。實驗還證實，HMGN3與人肝癌細胞的藥物（如長春花堿、拓撲替康、紫杉醇、阿霉素等）抵抗有關。HMGN3有望成為抗肝癌治療的一個靶點。

4 HMGN4

HMGN4是HMGN家族中研究最少的一種。Birger等［20］首次在基因庫數據搜索中發現一種HMGN2樣轉錄物，后被確認為HMGN4，其編碼基因是一種無內含子的基因，定位于人染色體6p21 HMGN4僅存在于靈長類動物，由90個氨基酸組成，大小約9.5 kD［21］。HMGN4在人體各組織中廣泛表達且具有差異性，甲狀腺、胸腺和淋巴結中HMGN4 mRNA水平較高，而肝臟、胰腺、睪丸及胎腦和胎肝中HMGN4 mRNA水平較低。目前尚未見HMGN4與疾病發生相關的報道。

5 HMGN5

Michael等于2000年通過Genbank數據庫檢索發現HMGN5。接著2001年King和Francomano發現HMGN5蛋白編碼基因的結構。HMGN5基因位于人Xp13染色體上，蛋白由282個氨基酸組成，大小約31.5 kD［11］。HMGN5包含經典的HMGN區域（NLS、NBD和RD），但其C端通常較長且有一獨特酸性氨基酸重復序列。在胚胎發育過程中，不同細胞或組織中HMGN5蛋白表達水平有很大不同。

HMGN5不僅能與核小體結合調節染色體的結構和功能，進而影響DNA的復制和修復，且在腫瘤發生發展中同樣發揮作用。有研究發現HMGN5蛋白在骨肉瘤［22］、乳腺癌［23］、膀胱癌［24］等多種腫瘤細胞中高表達。用小干擾RNA處理神經膠質瘤細胞使HMGN5水平降低，可使該細胞停滯于G1期且細胞凋亡比例增高，從而抑制膠質瘤細胞生長。利用包含HMGN5小發夾RNA的慢病毒質粒轉染前列腺癌細胞，96 h后前列腺癌細胞增殖能力減弱22. 6%，G2/M期和S期細胞分別增加8.78%和15. 26%，凋亡細胞比例增加2.19倍。小干擾RNA質粒處理膀胱癌EJ細胞系，處理組細胞活力較對照組下降了10.6%，流式分析結果表明細胞停留于G2期［24］。體外實驗［25］發現敲除HMGN5可使膀胱尿路上皮腫瘤5637細胞的體外增殖和侵襲能力減弱。敲除HMGN5能抑制5637細胞的成瘤能力。HMGN5高表達與腫瘤低分化、淋巴結浸潤及遠處轉移密切相關［23］。研究［26］發現，HMGN5可能通過上調自噬作用引起骨肉瘤細胞的藥物（如紫杉醇，甲氨蝶呤，順鉑等）抵抗。因此，HMGN5亦有望成為腫瘤治療中的一個新靶點。

總之，HMGN家族各成員作為細胞內的染色質結合蛋白，參與DNA復制與表達、細胞分化、器官發育及基因表達調控等多種細胞的生命活動。HMGN1、HMGN2通過調節某些基因或蛋白的表達來影響器官發育成熟，同時還參與腫瘤免疫反應。HMGN3與人2型糖尿病的發生及肝癌化療耐藥有關，因此可能用于預防2型糖尿病和增強肝癌化療療效。目前對HMGN4的研究相對較少，期望會有其與疾病相關性的研究，從而尋找更多的臨床疾病治療策略。HMGN5過表達是腫瘤浸潤和轉移的一個重要因素，因此應用特異性抑制劑和靶向藥物來阻礙HMGN5的促腫瘤作用，進而發揮抗腫瘤效力是有可能的。相信在不久的將來，HMGN家族能成為臨床腫瘤治療的新靶點，使更多惡性腫瘤患者從中獲益。

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1002-266X（2016）25-0103-04

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目（13JCYBJC41400；14JCTPJC00476）。

任秀寶（E-mail：rwziyi@yahoo.com）

2015-11-28）