人類肝癌細胞HepG2、Bel-7402和Li-7植入裸鼠體內后微量蛋白表達分析

曾小峻，陶華林，汪碧瓊，于卉（西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000）

人類肝癌細胞HepG2、Bel-7402和Li-7植入裸鼠體內后微量蛋白表達分析

曾小峻，陶華林，汪碧瓊，于卉
（西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000）

目的 探討HepG2、Bel-7402和Li-7不同肝癌細胞系在裸鼠體內生長過程中血清蛋白譜的表達情況，尋求與肝癌早期診斷相關的微量蛋白標志物。方法 將40只BALB/cA-nu裸鼠隨機均分為4組，分別為HepG2、Li-7和Bel-7402組以及對照組，對HepG2、Bel-7402和Li-7三種癌細胞分別進行培養和傳代，制備濃度為1.5×107/ mL癌細胞懸液，在每組裸鼠皮下分別注射相應的癌細胞懸液0.2 mL，對照組注射RPMI1640細胞培養基，觀察裸鼠的生長情況，于注射后20、40和60 d通過摘眼球法采集裸鼠血液樣本，用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜儀（SELDI-TOF-MS）檢測微量蛋白譜，采用Ciphergen ProteinChip 3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1軟件和統計學分析軟件SPSS16.0對所得的數據進行分析，篩選出差異性蛋白。結果 HepG2組將HepG2細胞注射裸鼠后，在裸鼠血清中出現29個差異蛋白，規律變化明顯的有8個，其中上調的有5個，下調的有3個。Li-7組將Li-7細胞注射裸鼠后，出現12個差異表達蛋白，其中表達增強的有7個，表達減弱的有5個。Bel-7402組將Bel-7402細胞注射裸鼠后，血清中出現5個差異蛋白，其中表達增強的有4個，表達減弱的有1個。結論 不同類型的肝癌細胞在裸鼠體內生長過程中會產生不同的微量差異蛋白，這些蛋白經鑒定、檢測開發有望成為臨床不同細胞類型肝癌早期診斷的蛋白標志物。

肝腫瘤；表面增強激光解吸電離飛行時間質譜儀；蛋白質組學；差異性蛋白；質荷比；裸鼠

肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，近年來發病率逐年上升，其病因與誘因多種多樣，尤其肝細胞性肝癌（HCC），病死率高［1］。肝癌實驗室檢查指標主要有甲胎蛋白（AFP）及其異質體、血清酶、異常凝血酶原、鐵蛋白等，但上述指標均有一定局限性，尤其敏感性和特異性在不同細胞類型的肝癌早期診斷中效果不佳，如何尋找肝癌早期診斷指標是目前倍受關注的問題之一［2，3］。2013年3月～2015年5月，我們通過在裸鼠皮下注射人類不同類型的肝癌細胞HepG2、Bel-7402和Li-7，分析在裸鼠體內與肝癌相關的蛋白表達情況?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/cA-nu裸鼠40只，4周齡，均為雌性，購于重慶騰鑫科技公司。HepG2、Li-7和Bel-7402細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。主要試劑和儀器：RPMI1640細胞培養基（GIBCO BRL公司，美國），胎牛血清（美國Hyclone公司），二甲基亞砜、甲醇、三氟乙酸、芥子酸、乙腈、HPLC級超純水等（美國Sigma公司），臺式高速離心機（安亭科學儀器廠，中國），二氧化碳恒溫孵育箱（Thermo，美國），超低溫冰箱（Thermo，美國），H50蛋白芯片（Ciphergen，美國），PBSⅡ/C型蛋白指紋圖譜分析儀（Ciphergen公司，美國）。

1.2 細胞培養與傳代 肝癌細胞株經復蘇后加入配制好的RPMI1640細胞培養液（90%RPMI1640細胞培養基+10%胎牛血清）約5 mL，擰松瓶蓋置于恒溫孵箱（37℃，5%CO2）中培養。當細胞貼壁面積大于80%時，立即傳代，棄原有培養液，PBS工作液洗滌2次，加入約1 mL的胰酶細胞消化液，將瓶底完全覆蓋，待細胞形態開始變圓，細胞間隙增大時，立即棄去胰酶細胞消化液，加入培養液以終止消化，用吸管將細胞輕輕吹打下來，使其分散開，成為單個細胞懸液。根據具體情況，將細胞懸液傳至2 ～3個新培養瓶內，同時加入新的培養液，使總液體維持在5 mL左右，隨后，擰松瓶蓋輕放入孵箱并輕晃培養瓶使細胞均勻分散于瓶底。

1.3 癌細胞懸液制備 選擇處于對數生長期的HepG2、Bel-7402和Li-7細胞，按照細胞傳代的步驟進行消化，離心（4 000 r/min，3 min）后棄上清液，加入RPMI1640細胞培養基（無胎牛血清）重懸細胞，隨后混勻計數，配制濃度約為1.5×107/mL的癌細胞懸液。

1.4 細胞分組及處理 將40只BALB/cA-nu雌性裸鼠隨機均分為4組，分別為HepG2組、Bel-7402組、Li-7組和對照組，每組裸鼠分別用相應的癌細胞懸液（1.5×107/mL）作皮下接種，劑量為0.2 mL，對照組接種RPMI1640細胞培養基。

1.5 裸鼠血清標本微量蛋白譜測定 各種癌細胞注射裸鼠后，分別于第20、40和60天時，采用摘取眼球法采集血標本，待血液凝固后離心（6 min，6 000 r/min），將獲得的血清分裝在新的Eppendof管中，做好標記，凍存于超低溫冰箱中備用。委托北京伯奧克蛋白指紋圖譜技術有限公司檢測微量蛋白譜。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。采用Ciphergen ProteinChip3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1軟件和對所獲得的數據進行分析，篩選出差異性蛋白，對兩組樣本進行差異表達增強或減弱的質荷比（M/Z）計算。

2 結果

2.1 HepG2細胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表達HepG2組將HepG2癌細胞注射裸鼠后，血清中出現29個差異蛋白，規律變化較強的有8個，其中上調的有5個，M/Z分別為3 701.15、4 560.87、8 169.14、8 258.08和1 2047.4；下調的有3個，M/Z分別為1 025.35、1 045.15和4 319.54。

2.2 Li-7細胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表達Li-7細胞注射裸鼠后，在Li-7組和對照組中同時出現12個差異表達蛋白，其中表達增強的有7個，M/ Z分別為1 087.44、1 179.59、1 192.62、1 483.17、1 563.21、6 646.16和3 763.01，表達減弱的有5個，M/Z分別為1 027.39、3 869.26、4 319.54、8 793.72和9 259.75。

2.3 Bel-7402細胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表達 Bel-7402細胞注射裸鼠后，在Bel-7402組和對照組裸鼠血清中同時出現的差異蛋白有5個，其中表達增強的有4個蛋白，M/Z分別為2 016、3 309、3 442、3 745，表達減弱的有1個蛋白，M/Z為2 747。

3 討論

在病理分類中，每一種腫瘤均有不同的亞型，其臨床表現和治療方法均存在差異，同一種腫瘤，細胞系也存在多個，不同細胞系的腫瘤，其發生、發展過程中，在體內的蛋白表達是否有差異，為了給臨床腫瘤早期診斷和治療提供更多的依據，全面了解腫瘤的特征，本研究根據中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心所提供的肝癌細胞系的情況，針對HepG2、Li-7和Bel-7402三種肝癌細胞在動物體內的生長和蛋白表達情況進行研究。

HepG2、Li-7和Bel-7402三種肝癌細胞在裸鼠中的致瘤性不同，只有Bel-7402肝癌細胞具有致瘤性，其他兩種細胞均不致瘤，可能原因：①每個作者研究所用裸鼠的品種及性別不完全相同；②有的研究使用的是自己實驗室保存的細胞系，可能是細胞在長期傳代過程中，出現了變異，造成其在裸鼠中致瘤的現象，亦可能是長期使用的細胞受到了其他腫瘤細胞的污染，使其具有了對裸鼠的致瘤特性；③有的肝癌細胞可能存在亞型，如國外有的作者使用的Li-7細胞形態與本研究所用細胞形態不同，表現出致瘤性不一。

同種腫瘤的不同細胞系代表了這種腫瘤的不同特性，它們之間在某些特性上可能存在差異，正如肝母細胞瘤和肝內膽管癌，它們同屬于肝癌，是肝癌的不同亞型，但它們在臨床表現和治療上均有差異，同時本研究結果顯示，HepG2、Li-7和Bel-7402三種肝癌細胞注射到裸鼠皮下后，在裸鼠血清中出現不同的微量蛋白表達，說明在不同細胞類型肝癌的早期診斷中應采用不同的腫瘤標志物，以提高臨床肝癌早期診斷的特異性。

SELDI-TOF-MS是蛋白組學研究的一種新技術，尚處在發展階段，尤其檢測過程的標準化、如何解決激光的衰減給結果帶來的影響等還需進一步完善，但其為我們篩選疾病的早期診斷指標提供了新思路，具有高通量、高靈敏度的特點，不僅可作為篩選指標診斷疾病的工具，亦是重要的科研手段。本研究所獲得的這些差異蛋白，很有潛力成為疾病的篩選指標，特別有助于腫瘤疾病的早期診斷。

［1］Xia H，Chen J，Shi M，et al.The over-expression of survivin enhances the chemotherapeutic efficacy of YM155 in human hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（8）：5990-6000.

［2］Zeng X，Tao H.Diagnostic and prognostic serum marker of cholangiocarcinoma［J］.Oncol Lett，2015，9（1）：3-8.

［3］Li X，Zou K，Gou J，et al.Effect of baicalin-copper on the induction of apoptosis in human hepatoblastoma cancer HepG2 cells［J］. Med Oncol，2015，32（3）：72.

［4］周薇，戴奇剛，鄧鑫，等.EGCG對人肝癌細胞株HepG2裸鼠移植瘤COX-2、VEGF和bFGF表達的調控［J］.中山大學學報（醫學科學版），2013，34（3）：364-370.

［5］于卉，陶華林.肝癌實驗室診斷的研究進展［J］.瀘州醫學院學報，2013，36（3）：305-307.

［6］常林，楊瑞麗.肝癌實驗室診斷研究進展［J］.生物技術通訊，2010，21（1）：136-138.

［7］羅福東，丁海明.腫瘤標志物聯檢對原發性肝癌診斷的研究進展［J］.國際醫藥衛生導報，2010，16（1）：122-124.

［8］李軍，李福濤，開麗，等.采用HepG2細胞株建立裸鼠肝癌模型的方法［J］.四川生理科學雜志，2002，24（2）：80-81.

［9］Genda T，Sakamoto M，Ichida T，et al.Cell motilitymediated by rho and Rho-associatedprotein kinase plays a critical role in intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol，1999，30（4）：1027-1036.

［10］Takamura M，Sakamoto M，Genda T，et al.Inhibition of Intrahepatic Metastasis of Human HepatocellularCarcinoma by Rho-Associated Protein Kinas Inhibitor Y-27632［J］.Hepatol，2001，33（3）：577-581.

［11］陶華林，汪碧瓊，楊洋.SELDI-TOF-MS技術對鼻咽癌裸鼠移植模型早期蛋白組學研究［J］.現代檢驗醫學雜志，2009，24（5）：21-25.

Expression of microproteins in nude mice injected with hepatoma cell lines of HepG2，Bel-7402 and Li-7

ZENG Xiaojun，TAO Hualin，WANG Biqiong，YU Hui
（The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）

Objective To investigate the serum proteinogram of hepatoma cell lines（HepG2，Bel-7402 and Li-7）which grow in the nude mice in order to find the microprotein markers which are associated with early diagnosis of hepatoma.Methods We classified 40 BALB/cA-nu nude mice into 4 groups randomly and marked them as HepG2 group，Li-7 group，Bel-7402 group and control group，respectively.Three types of hepatoma cell lines（HepG2，Bel-7402 and Li-7）were cultured and the cells were prepared into cell suspension（1.5×107/ml），respectively.We injected the cell suspension into the relevant groups with 0.2 mL in every mouse and the control group was injected with RPMI1640 medium. These nude mice were observed for 2 months and we got their blood on the 20th，40th，60th day by eyeball extirpating.We detected the proteinogram using surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry（SELDI-TOFMS）and then，we analyzed the data by Ciphergen ProteinChip 3.0 and Ciphergen Biomaker Wizard 3.1 and SPSS 16.0 to screen the differentiated proteins.Results After the mice in HepG2 group were injected with cell line HepG2，there were 29 differentiated proteins.Among them，8 proteins changed significantly and 5 proteins were up-regulated and 3 were downregulated.After the mice in Li-7 group were injected with cell line Li-7，there were 12 differentiated proteins.Among them，7 proteins enhanced，and 5 proteins weakened.After the mice in Bel-7402 group were injected with cell line Bel-7402，there were 5 differentiated proteins.Among them，4 proteins enhanced and 1 protein weakened.Conclusions Different subtypes of hepatoma cell lines injecting into nude mice can express different microproteins in the serum of mice. These proteins could be identified and detected to be promising markers of different subtypes of hepatoma for the early diag-nosis.

liver neoplasms；surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry；proteomics；differential protein；mass-to-charge ration；nude mice

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.002

R735.7

A

1002-266X（2016）25-0005-03

四川省科技支撐計劃項目（2013JY0102）。

曾小峻（1989-），女，技師，主要研究方向為腫瘤分子診斷。E-mail：393461933@qq.com

簡介：陶華林（1964-），男，主任技師，主要研究方向為腫瘤蛋白組學。E-mail：lzyxyjyx@163.com

2016-01-22）