四種外排泵抑制劑逆轉陰溝腸桿菌耐藥性效果比較

溫見翔，楊虹（北京大學深圳醫院，廣東深圳518036）

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四種外排泵抑制劑逆轉陰溝腸桿菌耐藥性效果比較

溫見翔，楊虹
（北京大學深圳醫院，廣東深圳518036）

摘要：目的 比較四種外排泵抑制劑碳氰間氯苯腙（CCCP）、利血平維拉帕米奧美拉唑逆轉陰溝腸桿菌耐藥性的效果。方法 收集多重耐藥陰溝腸桿菌36株，采用E-test方法檢測頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星、氨曲南對菌株的最低抑菌濃度（MIC），再分別檢測加入CCCP、利血平維拉帕米奧美拉唑后菌株對抗菌藥物的MIC，加入外排泵抑制劑后，MIC下降4倍或以上者判斷為外排陽性。結果 加入外排泵抑制劑后，篩選外排陽性株陽性率由高到低依次為CCCP 34．72%、利血平13．89%、奧美拉唑9．72%、維拉帕米5．56%；環丙沙星加入CCCP后外排陽性株數量最多，陽性率為58．33%。結論 四種外排泵抑制劑均可不同程度地逆轉陰溝腸桿菌的耐藥性，CCCP逆轉陰溝腸桿菌的耐藥性效果最佳。

關鍵詞：陰溝腸桿菌；碳氰間氯苯腙；利血平；維拉帕米；奧美拉唑

陰溝腸桿菌是臨床常見的條件致病菌之一，是醫院獲得性感染的重要病原菌。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌在抗菌藥物的選擇性壓力下出現高耐藥性和多重耐藥［1，2］。本研究對碳氰間氯苯腙（CCCP）、利血平維拉帕米奧美拉唑四種外排泵抑制劑逆轉陰溝腸桿菌耐藥性的效果進行比較，為多重耐藥陰溝腸桿菌感染的治療提供依據。

1　材料與方法

1．1材料 收集2010年5月～2013年6月北京大學深圳醫院患者痰液、尿液、血液、膿液、膽汁等標本中分離的多重耐藥陰溝腸桿菌36株［3］。使用Micro ScanWalkaway40細菌分析儀進行鑒定和藥敏試驗，同一患者同一部位分離出的陰溝腸桿菌，如藥敏結果相同，僅采用首次分離菌株。以大腸桿菌

ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質控菌株，藥敏結果依據CLSI（2013年）臨床微生物實驗室標準判定。頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星、氨曲南E-test藥敏試紙和光度比濁儀為法國梅里埃生物公司產品；CCCP購自Sigma公司，利血平購自廣東邦民制藥廠，維拉帕米購自上海禾豐制藥有限公司，奧美拉唑購自陜西博森生物制藥廠。

1．2外排泵抑制劑工作濃度的確定 采用外排泵抑制劑的抑菌試驗。分別配制含有不同終濃度外排泵抑制劑的MH瓊脂平板，其中CCCP的終濃度分別為5、10、15、20 μg／mL；利血平、維拉帕米、奧美拉唑的終濃度分別為20、40、60、80 μg／mL。分別將大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及36株多重耐藥陰溝腸桿菌接種含有不同終濃度外排泵抑制劑的MH瓊脂平板，以不含任何外排泵抑制劑的MH瓊脂平板做為空白對照。37℃培養16 ～18 h，觀察各菌株在含有不同終濃度外排泵抑制劑的MH瓊脂平板的生長情況，以各菌株不受抑制、生長良好的外排泵抑制劑最高濃度作為其工作濃度。最終確定CCCP、利血平、維拉帕米、奧美拉唑的工作濃度分別為10、40、60、60 μg／mL。

1．3外排泵抑制劑逆轉陰溝腸桿菌耐藥性作用觀察 采用E-test方法分別測試36株陰溝腸桿菌對頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星及氨曲南的MIC。相同方法分別檢測加入CCCP、利血平維拉帕米奧美拉唑后，陰溝腸桿菌對孢曲松、慶大霉素、環丙沙星和氨曲南的MIC。加入外排泵抑制劑后MIC下降4倍或以上判斷為外排陽性。

1．4統計學方法 采用SPSS17．0統計軟件。計數資料的比較采用χ2檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

3　討論

細菌的外排系統是通過細菌主動外排泵將擴散入菌體內的藥物或其他底物排出膜外，從而加強細菌在藥物選擇壓力下的生存能力，它是細菌的一種非特異性耐藥機制［4］。耐藥結節細胞分化家族AcrAB-TolC外排系統是導致革蘭陰性菌多重耐藥的重要因素［5～7］。陰溝腸桿菌染色體上存在AcrA、AcrB、AcrR、TolC基因，可以編碼AcrAB-TolC外排泵［8］，多重耐藥的陰溝腸桿菌存在活躍的AcrABTo1C外排泵，陰溝腸桿菌多重耐藥與主動外排系統有關［9～11］。我們的前期研究顯示，我院臨床分離的陰溝腸桿菌高水平攜帶AcrAB-TolC系統的AcrA、AcrB、AcrR、TolC四種基因［3］。外排泵抑制劑不僅可以抑制耐藥細菌對藥物的外排，恢復其對藥物的敏感性，而且可以改善某些藥物的藥動學特性（如提高口服藥物的吸收率，改善肝、腎清除率）［12］。本研究選取了頭孢菌素類的頭孢曲松、氨基糖苷類的慶大霉素、喹諾酮類的環丙沙星以及單環酰胺類的氨曲南作為外排泵底物，觀察外排泵抑制劑CCCP、利血平、維拉帕米、奧美拉唑對36株多重耐藥陰溝腸桿菌MIC的影響。結果顯示，加入外排泵抑制劑后，篩選外排陽性株陽性率由高到低依次為CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米。四種外排泵抑制劑與慶大霉素和環丙沙星聯合應用后，逆轉細菌耐藥性的效果較好。環丙沙星加入CCCP后篩選陽性菌株最多，陽性率為55．56%，慶大霉素亦是與CCCP聯合使用后篩選的陽性率最高（47．22%）。外排泵抑制劑對頭孢曲松MIC的影響最小，與CCCP聯合應用時僅出現3株陽性菌株，而與利血平、維拉帕米作用后均未出現陽性株。氨曲南與外排泵抑制劑共同作用后，僅有6株外排陽性菌株。分析其原因可能是陰溝腸桿菌對頭孢類和單環酰胺類抗菌藥物的耐藥機制主要是在抗菌藥物的誘導下，細菌產生β-內酰胺酶，包括AmpC酶、超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶等［13］。AmpC酶可水解三代頭孢菌素而不被β-內酰胺酶抑制劑所抑制，ESBLs能夠滅活三代頭孢菌素和氨曲南等抗菌藥物。而主動外排系統在陰溝腸桿菌對頭孢類和單環酰胺類抗菌藥物耐藥作用較小。

綜上所述，四種外排泵抑制劑對我院分離的多重耐藥陰溝腸桿菌均有不同程度耐藥逆轉作用，CCCP逆轉陰溝腸桿菌的耐藥效果最佳。外排泵抑制劑與抗菌藥物聯合使用為逆轉細菌耐藥提供了新的思路，但由于CCCP、利血平、維拉帕米、奧美拉唑的實驗劑量遠大于臨床常用劑量，不良反應較大，因此目前僅限于體外實驗，能否用于臨床仍需進一步研究。

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收稿日期：（2015-08-24）

基金項目：廣東省深圳市科技計劃項目（201203016）。

中圖分類號：R378．2

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X（2016）02-0064-02

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．027