外泌體在疾病診治作用中的研究進展

梁玲，李勝活，陳子夢（廣州醫科大學附屬第四附醫院，廣州510000）

外泌體在疾病診治作用中的研究進展

梁玲，李勝活，陳子夢
（廣州醫科大學附屬第四附醫院，廣州510000）

外泌體（Exosomes）是囊泡轉運的主要組成部分之一，囊泡轉運對于細胞發揮多種功能活動起重要作用。釋放至細胞外面的Exosomes參與一系列生物過程，如免疫應答、凋亡、血管生成、炎癥反應、凝結過程、腫瘤轉移、動脈硬化、抗原提呈和治療受損器官等。諸多研究表明，不同細胞來源的Exosomes，通常含有相同的一套蛋白質來調節膜骨架的動態性及膜融合；另外，Exosomes中還包含核酸物質，統稱為eRNA，Exosomes的生物學功能通過其攜帶蛋白質和miRNA等到達受體細胞而發揮調控作用。Exosomes可由樹突狀細胞、血小板、肥大細胞、內皮細胞間充質干細胞和腫瘤細胞等不同細胞類型分泌，并可在多數體液如外周血、尿液、唾液、羊水、乳汁、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等體液中檢測到。諸多研究表明Exosomes攜帶的mRNA、miRNA和蛋白質在疾病發生發展過程中會發生明顯變化，可作為疾病診斷的理想標記物。在Exosomes治療疾病研究方面，目前比較關注的是骨髓間充質干細胞和樹突狀細胞來源Exosomes的治療作用。

外泌體；腫瘤免疫；腫瘤血管新生；診斷；治療

外泌體（Exosomes）是由多種細胞分泌的40～100 nm的膜性小囊泡，由細胞內多泡體（MVE）出芽形成，再與細胞膜融合后釋放至細胞外基質中。細胞間的通訊可通過Exosomes攜帶mRNA、microRNA （miRNA）和蛋白質等到達受體細胞發揮調控作用。目前研究表明Exosomes攜帶的蛋白質、mRNA和miRNA與機體及細胞的生理疾病狀態密切相關，是潛在的理想生物標志物。另外，干細胞分泌的Exosomes是干細胞發揮治療作用的主要作用機制之一，樹狀突細胞的Exosomes還具有抗腫瘤免疫、促進腫瘤血管新生等生理功能。經過國內外科學家的努力，目前在Exosomes領域的研究取得較大進展。現將Exosomes在疾病診治中的研究進展綜述如下。

1 Exosomes的生物學特征

Exosomes是細胞分泌的一類40～100 nm的膜性小囊泡，是囊泡轉運的主要組成部分之一。囊泡轉運對于細胞發揮多種功能活動起重要作用，James等因發現細胞囊泡轉運調控機制而獲得2013年諾貝爾生理學醫學獎［1］。在囊泡轉運過程中，根據轉運過程中所處的位置不同將囊泡分為早期內涵體（EE）、晚期內涵體（LE）和循環內涵體（RE）［2］。其中，晚期內涵體會形成多泡體，多泡體進一步分泌一類直徑為40～100 nm的膜性囊泡——Exosomes［3］。釋放至細胞外面的Exosomes參與一系列生物過程，如免疫應答、凋亡、血管生成、炎癥反應、凝結過程、腫瘤轉移、動脈硬化、抗原提呈和治療受損器官等［4］。諸多研究表明，不同細胞來源的Exosomes，通常含有相同的一套蛋白質來調節膜骨架的動態性以及膜融合，這類蛋白如GTP酶的Rab家族、Alix、ESCRT蛋白、熱休克蛋白、膜聯蛋白等；另外，Exosomes中還包含核酸物質，統稱為eRNA，Exosomes的生物學功能通過其攜帶蛋白質和miRNA等到達受體細胞而發揮調控作用［5］。Exosomes可由樹突狀細胞（DC）、血小板、肥大細胞、內皮細胞間充質干細胞和腫瘤細胞等不同細胞類型分泌，并可在多數體液如外周血、尿液、唾液、羊水、乳汁、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等體液中檢測到［6］。諸多研究表明Exosomes攜帶的mRNA、miRNA和蛋白質在疾病發生發展過程中會發生明顯變化，可作為疾病診斷的理想標記物。并且將Exosomes從體液中分離出來用于監測，顯著降低了樣品復雜性，有利于生物標志物的檢出。因此，Exosomes為疾病診斷及標志物的探索提供了一個全新的思路和方向。不同細胞分泌的Exosomes會有不同的功能。在Exosomes治療疾病研究方面，目前比較關注的是骨髓間充質干細胞（MSC）和DC來源Exosomes的治療作用。

2 Exosomes中的miRNA對疾病的診斷作用

miRNA是一類長度為18～25 nt的小分子非編碼小RNA，廣泛存在于真核細胞中，能通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，調節細胞增殖、分化與凋亡，參與個體發育、機體代謝及腫瘤發生等。諸多研究已表明miRNA可作為腫瘤、肌肉損傷、炎癥等多種疾病的生物標志物［7］。目前有學者發現miRNA可選擇性組裝到Exosomes中，然后穩定存在于患者的血液、尿液和其他體液中，更有意義的是miRNA數量和組成在患者和正常人中存在差異，與疾病的發生發展密切相關，可作為疾病診斷的理想標記物。

在腫瘤標記物研究方面，Huang等［8］發現Exosomes中的let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a與結腸癌的發生密切相關。Kawata等［9］發現Exosomes中的miR-1290、miR-375可作為去勢難治性前列腺癌的診斷標記物。Riccardo和他的同事篩選肺癌和正常吸煙者血清Exosomes中的差異miRNAs，發現miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p可用于鑒定肺癌和正常吸煙者，另外，他們還發現miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p可用于區分肺腺癌和肺肉芽腫瘤患者［10］。有學者比較腫瘤和Exosomes中miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212和miR-214的表達情況，發現腫瘤中的表達情況和Exosomes中的表達情況無統計學差異，即檢測Exosomes中的差異miRNA可反映腫瘤實際情況，可作為腫瘤診斷標記物。Huang等［11］對前列腺癌患者血清中Exosomes 的RNA進行測序，發現在前列腺癌患者中miR-1290和miR-375呈高表達，且miR-1290和miR-375的表達與生存期密切相關。Cazzoli等［12］發現Exosomes中存在的差異miRNA分子和蛋白質可作為肺癌的篩查和診斷標記物，敏感性和特異性分別可達96.0%和76.0%。Roccaro等［13］通過microRNA芯片分析正常人骨髓間充質干細胞和多發性骨髓瘤患者骨髓間充質干細胞Exosomes的miRNA組成，發現miR-15a在多發性骨髓瘤患者骨髓間充質干細胞的Exosomes中明顯下調，并進一步探索發現他們與多發性骨髓瘤的特性密切相關。

在急性冠脈綜合征研究方面，Kuwabara等［14］發現Exosomes中的miR-1和miR-133a在急性冠脈綜合征患者中明顯升高，可作為其檢查的特異性標記物。有學者發現相對于正常人，心肌梗死患者尿液和血清Exosomes中miR-1和miR-208l的水平均明顯升高。在腎臟病研究方面，Lv等［15］通過RT-PCR檢測miR-29、miR-200在慢性腎病患者健康人尿液Exosomes中的表達情況，結果顯示miR-29水平明顯下降，ROC曲線結果顯示AUC為0.902，提示MicroRNA-29c對慢性腎病有較高的診斷價值。Wang等［16］發現IgA腎病患者尿液Exosomes中的miR-200a、miR-200b和miR-429明顯減少，進一步研究發現其減少的程度與疾病的嚴重程度呈負相關。Lv等［17］發現尿液Exosomes中的CD2AP mRNA是腎臟疾病的診斷標記物，他們分別收集了32例腎臟疾病患者和7例健康人的尿液，并分離Exosomes及其RNA，然后通過RT-PCR檢測CD2AP、NPHS2和synaptopodin的mRNA水平，結果顯示CD2AP mRNA水平在患者中明顯下降，ROC曲線分析結果顯示AUC值為0.821（P=0.008），說明Exosomes中的CD2AP mRNA對腎臟疾病的診斷有較高價值。

3 Exosomes中蛋白質對疾病的診斷作用

蛋白質組學是一門大規模、高通量、系統化的研究某一類型細胞、組織或體液中的所有蛋白質組成及其功能的新興學科，是對蛋白質翻譯和修飾水平等研究的一種補充，是全面了解基因組表達的一種必不可少的手段。目前在Exosomes研究領域，可通過蛋白質組學全面分析Exosomes中蛋白質的組成，從而更加全面了解Exosomes的功能及作用靶點，同時對探索疾病的標記物有重要意義。

在腫瘤研究方面有學者通過蛋白質組學技術發現膀胱癌患者尿液Exosomes中存在的差異蛋白可用于膀胱癌的早期診斷，并且證實Exosomes中的差異蛋白和膀胱癌組織間存在高度相關性。Roccaro等［17］通過蛋白質組學分析正常人骨髓間充質干細胞和多發性骨髓瘤患者骨髓間充質干細胞的Exosomes蛋白質組成差異，發現IL-6、CCL2和fibronectin在多發性骨髓瘤患者骨髓間充質干細胞中明顯上調，并進一步探索發現他們與多發性骨髓瘤的特性密切相關。

在其他疾病研究方面，有學者分別比較了帕金森患者和正常人尿液Exosomes中LRRK2或DJ-1的表達情況，發現在正常人和帕金森患者中差異不是很明顯，但當按照性別分析時，發現在男性帕金森患者中的DJ-1表達情況有明顯差異。有學者構建小鼠肝臟損傷模型，收集其尿液提取Exosomes進行蛋白質組學分析，發現28種未曾在Exosomes中報道過但與疾病密切相關的蛋白，其中Cd26、Cd81、Slc3A1和Cd10可作為肝臟損傷的標記物。有學者分別檢測HIV陽性患者血清Exosomes和無Exosomes血清中21個細胞因子和趨化因子的表達情況，發現大部分細胞因子在HIV陽性患者血清Exosomes中的相對表達量明顯升高，是HIV潛在的檢測標記物。

4 MSC來源Exosomes對疾病的治療作用

干細胞是一類未充分分化、具有自我更新、多向分化潛能的細胞，主要包括胚胎干細胞、誘導性多能干細胞等，它們為目前臨床難以治療的重大疾病提供了一種新的治療方法［18，19］。其中MSC具有取材方便、應用廣泛和免疫原性低等優點，是目前干細胞應用研究的熱點［20，21］。至于MSC治療疾病的機制，主要與其定向分化和旁分泌功能有關。有研究者發現從現在干細胞治療的動物實驗或臨床試驗觀察到的獲益主要來源于干細胞的旁分泌效應［22］，其中Exosomes是目前細胞旁分泌的主要研究熱點，諸多研究已證實干細胞修復器官的功能與其分泌的Exosomes密切相關。既往多項研究發現，MSC培養上清可能是通過生長因子、細胞因子等旁分泌效應對損傷組織起修復作用［23］。

在腎臟損傷治療方面，Bruno等［24］發現MSC來源的Exosomes對甘油誘導的SCID鼠急性腎損傷模型具有保護作用，其修復能力與其母體細胞無統計學差異。2011年該課題組通過進一步研究發現，MSC來源的Exosomes對缺血再灌注損傷誘導的非SCID SD大鼠急性腎功能損傷有保護作用，實驗組血清中的BUN和Cr水平明顯減低，差異有統計學意義。若預先用RNase處理Exosomes，雖然Exosomes的體積和表面黏附分子表達未發生變化，但Exosomes卻失去了腎臟保護作用，這提示Exosomes的腎保護作用可能通過RNA實現。Wang等［25］研究發現，與缺血再灌注組相比，MSC處理的缺血再灌注組、MSC來源Exosomes處理的缺血再灌注組BUN水平明顯下降、凋亡細胞明顯減少、炎癥因子水平明顯下降。

在皮膚創面治療方面，有學者構建了SD大鼠皮膚深Ⅱ度燒傷模型和體外皮膚細胞燒傷模型，然后用來源于MSC的Exosomes進行治療，以肺成纖維細胞的Exosomes作為對照組，發現經MSC的Exosomes治療后，SD大鼠皮膚深Ⅱ度燒傷模型的創面愈合率、細胞存活、上皮化情況和PCNA表達情況明顯優于對照組。同樣體外皮膚細胞燒傷模型的增殖情況、存活率和PCNA表達情況明顯優于對照組。進一步研究發現，來源于骨髓間充質干細胞的Exosomes通過激活wnt4/β-catenin和AKT通路促進皮膚創面愈合。Zhang等［26］利用人誘導多能干細胞起源MSC的Exosomes注射于大鼠創面周圍皮下，結果顯示MSC的Exosomes可促進上皮化，減少痂皮寬度，促進膠原成熟、促進新生血管形成和促進創面成熟。同樣，在體外試驗發現人誘導多能干細胞起源MSC的Exosomes以劑量依賴方式刺激人真皮成纖維細胞和靜脈內皮細胞增殖和遷移，另外，Ⅰ、Ⅲ型膠原和彈性蛋白分泌及mRNA表達亦隨Exosomes濃度增加而增加。

在心肌梗死治療方面，Feng等［27］發現經預缺氧的MSC可分泌攜帶有miR-22的Exosomes作用于心肌細胞的靶基因Mecp2從而保護心肌細胞，保護心肌缺血模型。在肝臟損傷治療方面，Tan等［28］用來源于MSC的Exosomes和四氯化碳（CCl4）一起注射到小鼠中，發現Exosomes可減輕CCl4對肝臟的損害，進一步檢測發現肝實質細胞的存活率和PCNA表達量明顯優于對照組。說明在MSC修復靶器官過程中Exosomes旁分泌效應有重要作用。

5 DC來源Exosomes對疾病的治療作用

DC是目前功能最強的抗原呈遞細胞，能刺激初始型T細胞增殖，激發機體免疫應答。近年來，DC釋放的有生物學活性的Exosomes引起了人們極大興趣，其顯示出呈遞生物相關抗原、具有免疫治療作用的特性。有研究發現成熟DC分泌的Exosomes （mDex）激活抗原特異性T細胞的能力比未成熟DC分泌的Exosomes（imDex）強，進一步比較其分子組成顯示，與imDex相比，mDex含較豐富的B7.2、MFG-E8較少且幾乎無FasL［29］。任亞娜等［30］發現DC來源的Exosomes可通過其表面分子引起T細胞免疫應答，他們通過實驗阻斷DC來源Exosomes上部分分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后檢測Exosomes免疫學功能，結果顯示阻斷這些分子均能不同程度地抑制Dex對T細胞刺激的作用。

綜上所述，Exosomes的發現豐富了我們對細胞間通訊方式的認識，有利于加深我們對機體生理、病理過程的理解。目前對Exosomes的研究主要集中于疾病的標記物探索及對疾病的治療作用上。但介導相應RNA和蛋白質進入Exosomes的轉運信號機制仍不清楚，且Exosomes的分泌機制、融合機制亦需進一步研究，才能更好地將其利用于研究或臨床應用中。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.038

R730

A

1002-266X（2016）25-0107-04

廣州市屬高校科研項目（1201430440）。

李勝活（E-mail：chrisleeone@qq.com）

2016-03-24）