FrzA基因轉導干預對大鼠體外缺血缺氧心肌細胞Wnt信號通路相關分子表達及細胞凋亡的影響

李華垠，陶靜，馬依彤，劉芬，陳邦黨

(1新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054；2新疆心血管病研究重點實驗室)

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FrzA基因轉導干預對大鼠體外缺血缺氧心肌細胞Wnt信號通路相關分子表達及細胞凋亡的影響

李華垠1，2，陶靜1,2，馬依彤1,2，劉芬2，陳邦黨2

(1新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054；2新疆心血管病研究重點實驗室)

目的探討重組9型腺相關病毒(rAAV9)攜帶FrzA基因轉導對心肌細胞缺血缺氧模型Wnt信號通路活性的抑制作用及心肌細胞凋亡的影響。方法 分離培養SD大鼠心肌細胞，將rAAV9攜帶FrzA基因轉導至心肌細胞，在rAAV9表達高峰時建立心肌細胞缺血缺氧模型。隨機分為空白組、缺血缺氧組、缺血缺氧+rAAV9-CMV-eGFP組(空病毒組)、缺血缺氧+rAAV9-CMV-FrzA組 (FrzA組)。采用RT-PCR檢測各組心肌目的基因FrzA的表達；Western blotting 測定心肌細胞Wnt信號通路關鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc水平及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。結果rAAV9轉染第5天，目的基因FrzA在心肌細胞中高表達(P<0.05)。缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組Wnt信號通路關鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表達及凋亡蛋白Bax/Bcl-2值較空白組明顯升高(P均<0.05)。FrzA組心肌細胞中Wnt信號通路關鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表達及凋亡蛋白Bax/Bcl-2值低于缺血缺氧組、空病毒組(P均<0.05)。結論 rAAV9介導的FrzA基因轉導可有效干預Wnt信號通路，抑制其活性，從而減輕心肌細胞凋亡。

心肌細胞；缺血缺氧；重組9型腺相關病毒；FrzA基因；Wnt信號通路；細胞凋亡

心肌細胞缺血缺氧是導致心肌細胞凋亡、造成心肌梗死的重要病理基礎[1]。Wnt信號通路是一個調節機體生長發育、疾病、衰老及細胞分化凋亡的重要信號通路，在動物心臟發育過程中起到關鍵作用[2]。大量研究表明，Wnt信號通路在成人健康的心臟中是沉默的，心肌梗死后Wnt信號通路被持續激活，從而刺激細胞凋亡，加速心室重塑的進程[3～5]。可溶性Frizzled相關蛋白1(FrzA)是一種分泌型糖蛋白，它通過與Wnt信號通路的特異性受體卷曲蛋白受體競爭性結合Wnt蛋白，從而抑制Wnt信號通路的活性[6]。2015年10～12月，我們建立大鼠體外心肌細胞缺血缺氧模型，觀察FrzA基因轉導對心肌細胞Wnt信號通路過度表達的抑制作用及其心肌細胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料1～3 d 新生SD乳鼠(由新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物中心提供)、DMEM培養基(Gibco，美國)、FBS(Gibco，美國)、雙抗(青霉素鏈霉素溶液)(HyClone，美國)、谷氨酰胺(Sigma，美國)、D-Hanks(Sigma，美國)、胰蛋白酶(Sigma，美國)、Ⅱ型膠原酶(Worthington，美國)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Sigma，美國)、恒溫離心機(Thermo，美國)、二氧化碳培養箱(Thermo，美國)、垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)、倒置熒光顯微鏡(LEICA，德國)、9型腺相關病毒(rAAV9)-GFP及rAAV9-CMV-FrzA(構建包裝純化來自美國Virovek公司)、PCR引物(設計及合成來自上海生物工程有限公司)、PCR試劑盒(Fermentas，美國)、TRIzol抽提RNA試劑盒(Invitrogen，美國)。抗兔的β-catenin、c-Myc、Bcl-2、Bax、GADPH的多克隆抗體(CST，美國)、抗兔的Dvl-1的多克隆抗體(Abcam，美國)

1.2乳鼠心肌細胞原代培養及分組采用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶依次消化法獲取乳鼠心肌細胞，并用差速貼壁法和化學抑制法進行純化，分離培養具體方法見文獻[7]。取原代培養3 d的心肌細胞，隨機分空白組、缺血缺氧組、缺血缺氧+rAAV9-CMV-eGFP組(空病毒組)、缺血缺氧+rAAV9-CMV-FrzA組 (FrzA組) 。

1.3FrzA基因轉導將心肌細胞以每皿5×105個接種于直徑60 mm培養皿，用含10%FBS的高糖培養基培養3 d后棄去培養基，無血清DMEM培養基輕洗細胞2次, rAAV9-CMV-eGFP和rAAV9-CMV-FrzA分別加入無血清的DMEM培養基中，使其覆蓋細胞表面。37 ℃、5%CO2孵育2 h后補加DMEM及FBS，使FBS的濃度為10%，在37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養。

1.4心肌細胞缺血缺氧模型建立在病毒轉染第5天時建立心肌細胞缺血缺氧模型，用PBS洗滌細胞2～3次，加入模擬缺血液(無糖DMEM，并且不添加FBS)，將細胞置于三氣培養箱中，通入95%N2、5%CO2的混合氣體，30 min后停止通氣并密封。培養持續12 h。

1.5心肌細胞FrzA mRNA表達檢測采用RT-PCR法。以TRIzol法提取各組心肌細胞中的RNA后鑒定純度，反轉錄過程嚴格參照試劑盒進行。PCR條件為:94 ℃變性2 min，根據不同引物選取不同退火溫度，72 ℃延伸30 s，共35個循環后，再延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以β-actin作為內參，檢測心肌細胞FrzA mRNA表達。

1.6心肌細胞Wnt信號通路相關分子表達及凋亡蛋白檢測采用Western blotting法。收集各組細胞，經裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加樣總蛋白量40 μg，以上樣緩沖液等體積稀釋。4 ℃冰浴下SDS-PAGE電泳，濕轉到PVDF膜上，常規0.05%TBST洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育相應一抗、二抗，然后加入顯色液，放入化學發光儀曝光。用Image lab圖像分析軟件對Western blotting圖片進行分析，以GADPH蛋白作為參照，檢測心肌細胞Wnt信號通路相關分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表達。檢測心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達，以Bax/Bcl-2值評價細胞凋亡情況。

2　結果

2.1各組心肌細胞FrzA mRNA表達空白組、缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組的FrzA mRNA相對表達量分別為0.24±0.12、0.27±0.15、0.24±0.16、2.25±0.17。與空白組、缺血缺氧組、空病毒組比較，FrzA組心肌細胞FrzA mRNA表達明顯增強(P均<0.05)。

2.2各組心肌細胞Wnt信號通路相關分子表達空白組、缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組的β-catenin相對表達量分別為0.024±0.001 2、0.083±0.003 4、0.081±0.005 7、0.058±0.002 5，Dvl-1相對表達量分別為0.13±0.025、0.29±0.034、0.28±0.037、0.15±0.023，c-Myc相對表達量分別為0.022±0.002 3、0.071±0.003 6、0.067±0.002 5、0.045±0.003 5。缺血缺氧組、空病毒組及FrzA組Dvl-1、β-catenin、c-Myc在心肌中的表達均高于空白組(P均<0.05)。與缺血缺氧組、空病毒組相比，FrzA組Dvl-1、β-catenin、c-Myc的表達降低(P均<0.05)。

2.3各組心肌細胞凋亡情況空白組、缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組的Bax/Bcl-2值分別為1.25±0.45、3.52±0.41、3.47±0.39、2.26±0.49。缺血缺氧組、空病毒組及FrzA組Bax/Bcl-2值均高于空白組(P均<0.05)。與缺血缺氧組、空病毒組相比，FrzA組Bax/Bcl-2值降低(P均<0.05)。

3　討論

研究表明，Wnt信號通路正常情況下是沉默的，在各種病理狀態下被重新激活。在體外研究發現，小鼠心肌組織在缺血缺氧狀態下，Wnt信號通路被過度激活，并誘導了心肌細胞的凋亡[8]。本實驗研究在細胞水平證實，與正常心肌細胞相比，在心肌細胞缺血缺氧模型中，Wnt信號通路的相關分子β-catenin、Dvl-1、c-Myc表達增強，說明心肌細胞在缺血缺氧的狀態下Wnt信號通路被重新激活，心肌細胞凋亡增加。

近年來，干預Wnt信號通路從而防治心血管疾病已日益受到重視，研究人員從Wnt信號通路的不同階段對其活性進行干預。抑制Wnt信號通路的活性，將減少心肌細胞凋亡，縮小心肌梗死面積，改善心功能[9]。然而在以前的研究中，大都是通過轉基因小鼠或基因敲出小鼠的方法干預Wnt信號通路，這樣會同時對所有組織和細胞造成影響，胚胎死亡率[10]和心梗后心臟破裂都會大大增加。研究證實，rAAV9對心肌有極強的靶向親和力[11]，可長期穩定地表達外源基因，是目前心臟疾病基因治療的最佳載體[12]。因此本實驗中，我們利用rAAV9載體攜帶FrzA基因靶向干預心肌，避免了對其他組織和細胞的影響。

FrzA與Wnt信號通路中的frizzled受體有著相似的富含半胱氨酸區的分泌蛋白，因缺乏穿膜區而不能和質膜結合，但可與間質中循環的Wnt結合，從而阻止Wnt蛋白與質膜上的frizzled受體結合，對Wnt信號通路起負調控作用[13]。Duplàa等[14]報道，FrzA基因主要在主動脈內皮、心臟、脾臟、眼睛、血管等組織中表達，在胚胎期血管發生早期及血管形成過程中發揮重要作用。研究證實，FrzA 基因的過表達能抑制小鼠急性心肌梗死后Wnt通路的激活，顯著減少心肌梗死面積，減少炎性細胞浸潤，抑制心肌細胞凋亡，增加毛細血管密度，使心臟破裂發生率降低50%，最終減輕心室重塑、改善心功能[15]。本研究在細胞水平證實，FrzA基因轉染可以有效抑制缺血缺氧時被激活的Wnt信號通路，使Wnt信號通路關鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc水平及凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax值降低，減少了缺血缺氧造成的心肌細胞凋亡，從而為基因治療缺血性心臟病提供了新的思路。

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Effects of FrzA gene transduction on Wnt signaling pathway expression and apoptosis of cardiomyocytes in rats with ischemia-hypoxia in vitro

LIHuayin1,TAOJing,MAYitong,LIUFen,CHENBangdang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant adeno-associated virus type 9 (rAAV9) carrying FrzA gene transduction in inhibiting Wnt signaling pathway activity and on myocardial apoptosis of cardiomyocytes in rat models with ischemia-hypoxia.MethodsThe myocardial cells of SD rats were isolated and cultured. A recombinant AAV9 vector carrying FrzA gene was transfected into cardiomyocytes and then a hypoxia model was created. We divided them into four groups: control group, ischemia-hypoxia group, ischemia-hypoxia + empty virus (rAAV9-CMV-GFP) group (empty virus group) and ischemia-hypoxia + rAAV9-CMV-FrzA group (FrzA group). RT-PCR was used to detect the expression of target gene FrzA, and Western blotting was applied to detect the levels of Dvl-1, β-catenin and c-Myc as well as expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax. ResultsOn the fifth day after virus transfection, the FrzA target gene was highly expressed in cardiomyocytes (allP<0.05). The expression of Wnt signaling pathway molecules Dvl-1, β-catenin and c-Myc was significantly higher in the ischemia-hypoxia group, empty virus group and FrzA group, and the ratio of Bax/Bcl-2 was also higher than that of the control group (allP<0.05). The expression of Wnt signaling pathway molecules Dvl-1, β-catenin and c-Myc was significantly lower in FrzA group, and the ratio of Bax/Bcl-2 was also lower than that of the ischemia-hypoxia group and empty virus group (allP<0.05).Conclusion rAAV9 carrying FrzA gene can effectively intervene the Wnt signaling pathway and inhibit its activity and thus reduce the apoptosis of cardiomyocytes.

cardiomyocytes; ischemia-hypoxia; recombinant adeno-associated virus type 9; FrzA gene; Wnt signaling pathway; apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81470468)；新疆維吾爾自治區研究生創新基金資助項目(XJGRI2015064)。

李華垠(1990-)，男，住院醫師，主要從事心血管內科疾病的診治。E-mail：332075368@qq.com

簡介：馬依彤(1961-)，男，主任醫師，教授，主要從事心血管疾病基礎研究及臨床治療。其心血管病相關研究獲新疆維吾爾自治區科技進步獎、烏魯木齊市科技進步獎、新疆醫學科技進步獎多項。E-mail：myt-xj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.003

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0008-03

2016-01-14)