怎樣做好正向間接血凝試驗

王亞琴　張永勇　劉綏榮　肖港會

（①湖南省邵陽縣畜牧水產局　422100　②湖南省邵陽縣塘渡口鎮動物防疫站）

怎樣做好正向間接血凝試驗

王亞琴①張永勇①劉綏榮②肖港會①

（①湖南省邵陽縣畜牧水產局422100②湖南省邵陽縣塘渡口鎮動物防疫站）

間接血凝實驗（IHA）是一種簡單、快速、適用的血清學診斷技術，但實驗結果受操作技術、器材、樣品影響較大，本人根據多年的實踐體會，現就實驗中器材、試劑、樣品、過程和判定標準等方面的優化做一綜述，以期作為本實驗的借鑒。

正向間接血凝試驗因其準確度較高、操作相對簡單實用、檢測成本相對較低深受縣級縣級獸醫實驗室的青睞。間接血凝試驗（IHA）是上世紀六十年代在我國發展起來的血清學診斷技術，是用已知血凝抗原致敏與免疫無關的惰性微粒表面（載體）檢測未知血清抗體的試驗，迄今仍在許多疫病診斷中廣泛應用。林琳等研究表明應用豬瘟正向間接血凝法（IHA）與斑點酶聯免疫吸附試驗（dot-ELISA）以及豬瘟抗體免凝金標試紙條比較，對規模化養豬場138份不同階段豬血清進行檢測，三種方法檢測抗體的陽性率結果接近［1］［2］。數十年來正向間接血凝試驗技術不斷完善，具有簡單、經濟、快速、實用的特點，在我國有很大的用戶群，特別是規模養殖場也逐漸在使用這種診斷方法來診斷動物疫病和抗體水平，使得近年來，蘭州獸醫研究所生產的豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗的試劑用量在逐年加大；然而，該實驗結果受影響因素較多。為做好正向間接血凝試驗，使免疫抗體低的家畜能及時得到補免，有效地避免疫病風險。

1　試驗器材的選擇

本試驗所使用的試驗器材包括微量血凝板，微量振蕩器，移液器和吸頭，為保證試驗的順利進行，要選擇質量有保障，穩定性好的器材，要從正規有資質的廠家或代理商處進貨，。

1.1微量血凝板實驗室經常使用的是有機玻璃材質1100底角的96孔V型微量血凝板，此板可以疊放，不占實驗室臺面，處理樣品量較大時合適；如果1100底角的96孔V型微量血凝板不夠或未購買，就選用90o板子做實驗，清洗方法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于37℃溫箱中烘干。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈，如發現有透光性差一點的孔，可用酒精棉簽擦凈。除了有機玻璃板以外，還有一次性血凝板，不需清洗，也不用擔心板子不干凈影響結果，但不能疊放，測定少量樣品適合；注意：微量血凝板在做完實驗后要馬上洗干凈，否則時間久了再怎么洗也洗不干凈的。

1.2微量振蕩器使用振蕩器振蕩時間不宜超過10～20s鐘，振蕩強度不能太大，先從小到大，最后到中等強度即可；多塊板疊加后振蕩時要用手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實驗結果的準確性；如果實驗室沒有它，也可用手輕拍血凝板的邊緣20秒即可；以上兩種方法均已血球分布均勻為準。

1.3單、多道微量移液器建議使用高質量的移液器，如eppendorf移液器，用定量移液器需要準備50μl和25μl兩種。50μl的用來加稀釋液和稀釋血清，25μl的用來加血凝抗原。可調的移液器要選擇與檢測過程中加樣量相近量程的移液器，吸取液體時動作要輕緩，防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造成堵塞漏氣。一定要養成移液器用完后放在移液器架上把移液器恢復到最大量程的習慣；移液器要輕拿輕放，移液器如果掉到地下很容易損壞。用完后移液器用75%的酒精棉擦拭消毒。

2　試劑的選擇

2.1抗原液體正向血凝抗原搖勻后呈棕紅色或咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團）的抗原建議不要使用，抗原放置時一定要垂直放置，使血球團處于液體中。一瓶抗原可以檢測20～30份血清。值得一提的是液體正向血凝抗原4～8℃保存，保存期3個月，不能冷凍保存。

1.4吸嘴吸嘴一定要使用質量優良的國產吸嘴或進口吸嘴，決不能使用劣質吸嘴，否則會引起吸上來的液面不一樣高；高質量的吸嘴經過處理后可以重復使用。處理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超聲波清洗器處理10min，換水后用二層紗布包好，用洗衣機甩干，再用超聲波清洗器處理10min，再用洗衣機甩干，高壓消毒滅菌器中121℃，20min即可，去蓋后任水分蒸發，或放37℃溫箱中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗干凈，不必重復使用。接觸過高感染性材料的吸嘴要高溫消毒后廢棄。經過處理后的吸嘴如果尖頭變彎，則質量不好，不要重復使用。

2.2對照血清陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血清微紅或淡黃色略微粘性的液體。陰陽性對照血清應在4到8℃保存，有效期3個月。

2.3稀釋液稀釋液無色透明或呈淡黃色，一般情況4～8℃保存。用前建議將稀釋液放37℃溫箱中0.5h后搖勻再用較好。

3　樣品血清的處理和優化

離心時，一般轉速應設置為4000～12000轉/min×3～5min之間，如果所買的離心管較差易爛則轉速設低些時間設置長些；如只出點血清，則第二次重新離心（最好離心前用牙簽等把已凝固的血液與離心管壁劃開劃松），則血清會增多，多到一定時候，再離心血清也不會增多；空間很大的離心管（如5ml真空管），靜置一段時間（如一晚），一般會很好地析出血清來；多數帶紅色的血清靜置2h左右上部會變成清亮的，僅下端有一紅點，或離心后也會變成這樣，但有少部分離心后照樣會是帶紅色的血清；離心后有極少部分血清會成膠凍狀，處理辦法是戳碎并重新離心后速倒出血清，以免重新膠結；根據檢測次數和備份的需要確定最少的血清需要量，血清有0.5～1.0ml一般夠了。新分離血清應盡快檢測完，未檢血清-15～-20℃保存。冷凍血清待檢時需融化，同時避免血清反復凍融影響檢測結果，最好需經過56℃水浴滅活30min。嚴重溶血、嚴重污染、腐敗、變黑或有懸浮雜質的血清樣品不宜檢測，以免發生非特異性反應，從而影響判定結果。實驗過程優化

4　正向血凝試驗過程

包括加稀釋液、稀釋待檢血清、稀釋陽性陰性血清、加血凝抗原、震蕩靜置、結果判定。在通常的試驗當中，為了節約試劑和血凝板，一般橫向做到第8孔就夠了，現以做到第8孔為例講講在試驗中要注意的問題：

4.1加稀釋液為簡便起見，先在血凝板上所有的孔上各加稀釋液50μl。

4.2稀釋待檢血清和陰陽性血清取1號待檢血清50μl加入第1排第1孔，并將槍頭插入孔底，混勻后，從該孔吸取50μl移入第2孔，混勻后從該孔吸取50μl移入第3孔，直至第8孔。此時第1排1～8孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數）依次為1∶2、1∶4、1∶8、…….1∶256。每個待檢血清樣品均按上述方法稀釋。在稀釋血清操作時注意不要產生很多氣泡，每稀釋一份血清要換吸嘴，每次試驗要做陰陽性對照各2～3排，做二排空白對照，即孔中加50μl稀釋液后加25μl抗原。

4.3加血凝抗原被檢血清各孔、陰性對照各孔、陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原25μl。血凝抗原用前要充分搖勻，瓶底應無血球沉淀。一次試驗過程應選擇同一批號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避免吸嘴和孔內的液體直接接觸。

4.4振蕩混勻將血凝板置于微量振蕩器上振蕩10～20s，如發現孔中有氣泡可用電吹風吹滅。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，以沒有血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下靜置2h或37℃下靜置1～1.5h判定結果；在20℃室溫下不能超過5h看，否則會不準確；也可將板置冰箱中冷藏延至次日判定。

5　判定標準

（1）將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1∶16孔和稀釋液對照孔，均應無凝集（血球全部沉于孔底形成邊緣整齊的小圓黑點），或僅出現“+”凝集（血球大部分沉于孔底，邊緣稍有少量血球凝集）。（2）陽性對照血清1∶2到1∶256各孔（1～8孔）應出現“++”到“++++”凝集為合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如圖1所示，該陽性血清滴度為1∶256倍或記為8log2。（3）在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以呈現“++”凝集的最大稀釋倍數為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清1～5孔呈現“++”到“++++”凝集，6-8孔呈現“++”凝集，那么就可判定該份血清的抗體效價為1：256，或者說8log2。（4）接種口蹄疫和豬瘟疫苗的畜群免疫抗體效價達到1∶32（即5log2；第5孔）呈現“++”凝集（呈現為散開的白色云霧狀）為免疫合格。不少地方作抗體篩檢時樣品血清只稀釋8個孔，加血凝抗原時只加第3、4、5、6、7孔，只要第5孔（含）以上出現凝集的就判該血清為陽性，否則為陰性（呈現為小黑圓點狀為不合格）。這種方法可以大量減少試劑的用量。值得注意的是，有時盡管小心翼翼的按標準做了，又重做了，但是，還是會出現部分比陰性對照散得開看不到小圓黑點又沒陽性對照白黃的樣品，筆者認為應該把這些樣品也視為陽性，因為經其他試驗室多次比對這些樣品一般檢測為陽性結果，不過，為了保險起見，建議這種檢測結果最好降一格判定。

6　值得探討的問題

不同血凝板的孵育時間和判定：試劑盒要求使用110度底角的血凝板，但不少實驗室仍在使用90度底角的血凝板。如果使用的是90度底角的血凝板，結果判斷時會存在一定的差異，一般結果會偏低一些。在判讀結果的時間上，90度底角的血凝板判讀結果在1.5～2h，低于1h會判斷不準，多出現高判結果的現象。而110度底角的血凝板，判讀結果時間應在2h后為妥，冬天還可適當長一點，低于1.5h會判斷不準。使用90度底角的血凝板要注意掌握好判讀結果的時間，也要注意樣品凝集圖形的梯度變化情況。如果前4個孔為100%凝集，標記為“#”或有的標記為“++++”，第5孔為成片、塊狀的凝集，不是均勻分布，也不是多數血球沉于孔底，這時結果可以結合第4孔為100%的情況，判終點為第5孔。如果判為第4孔則判嚴了。如果是110度底角的血凝板就不存在這種情況了。第4孔和第5孔的判斷是這個試驗的關鍵，判了第4孔則該份血清為陰性，判了第5孔則為陽性，陰陽之差往往就在這一下，所以要特別引起重視。

［1］ 范明遠編. 于恩庶論文集［C］. 北京∶ 中華流行病學雜志編輯部，1988∶ 399-403.

［2］ 林琳， 江斌， 吳勝會等. 三種豬瘟抗體檢測技術的應用比較［J］. 福建畜牧獸醫， 2004，6（3）∶ 23-24.

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