豬瘟流行病學及診斷方法研究進展

陳　強，梁禮南2（.廣西壯族自治區桂平市江口鎮水產畜牧獸醫站，廣西 桂平 537229；2.廣西壯族自治區玉林市安勝動物科技有限公司，廣西 玉林 537000）

豬瘟流行病學及診斷方法研究進展

陳強1，梁禮南2
（1.廣西壯族自治區桂平市江口鎮水產畜牧獸醫站，廣西 桂平 537229；2.廣西壯族自治區玉林市安勝動物科技有限公司，廣西 玉林 537000）

摘要：本文從豬瘟流行病學及診斷學等方面闡述了豬瘟目前的流行特點及其診斷方法的研究進展，為基層動物防疫工作人員充分了解該病提供參考。

關鍵詞：豬瘟；流行病學；診斷方法

為了充分認識豬瘟的流行現狀，促進防控工作有效開展，本文就豬瘟的流行、診斷方法等進行綜述。

1　豬瘟流行病學

1.1臨床發病特點

1.1.1呈散發性流行且發病表現溫和。當前豬瘟的流行形勢從頻繁發生的大流行性轉為地區性、散發性流行。在發病表現上，既有高死亡率的急性、典型豬瘟，又有持續感染的溫和型、非典型豬瘟，還有無名高熱或隱性豬瘟。

1.1.2發病日齡偏小。仔豬發病急，病死率高，特別是斷奶前后和出生10日齡以內的仔豬較為多見。成年豬發病較輕或耐過（隱性帶毒），病理變化不明顯，需進行實驗室檢測確診。

1.1.3與其他疾病混合感染的現象比較普遍。豬瘟常與藍耳病、偽狂犬病、豬肺疫、弓形蟲病、豬丹毒等病混合感染，并多繼發鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病、氣喘病、附紅細胞體病及仔豬副傷寒等［1］，導致病情復雜，給診斷和治療帶來了很大難度。

1.2病毒基因型據報道，目前我國流行的豬瘟病毒基因型主要為基因2群，占74.66%，基因1群只占25.34%，而我國的豬瘟兔化弱毒疫苗株為基因1群［2］。可見豬瘟病毒基因型已發生重大變化。

1.3豬瘟病毒的主要儲存宿主種豬持續感染且帶毒是我國豬瘟難控制的重要原因，種豬已成為豬瘟病毒的主要儲存宿主。目前，在實驗室條件下已首次成功地利用豬瘟野毒人工復制帶毒母豬動物模型，此母豬可帶毒750d，甚至可以終生帶毒、排毒，血液中的含毒量可達到105～106PFU/mL。利用該模型的帶毒母豬自然交配或人工授精，可使使其產下帶毒仔豬，用健康陰性豬與之同居，會造成同居豬感染。另外，利用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒的基因型，發現帶毒公豬的病毒基因型與其自然交配所產死胎的病毒基因型是一致的，說明豬瘟病毒能通過公豬精液垂直傳播。

1.4豬瘟免疫目前有些豬場經常出現免疫過了豬瘟疫苗還是有豬瘟發生的問題，分析免疫失敗的原因，可能存在以下情況：（1）種豬存在持續感染和帶毒現象，導致出生仔豬往往成為持續感染者，這種感染豬不能建立中和性抗體應答，形成免疫耐受；（2）圓環病毒、偽狂犬病毒和豬藍耳病病毒的混合感染可造成豬瘟病毒在體內滯留而形成持續感染，影響豬瘟疫苗的免疫效果；（3）由于我國豬瘟疫苗中的病毒含量比國際標準差得遠，免疫劑量不足而易導致免疫失敗。

2　診斷方法

目前，根據不同的實驗原理建立了許多豬瘟檢測方法，概括起來可分為三大類，分別為病原學方法、血清學方法及分子生物學方法。

2.1病原學方法對CSFV的直接分離鑒定是診斷豬瘟最為經典可靠的方法。取疑似病豬的組織如扁桃體、脾臟、淋巴結等經過一些處理后接毒于PK-15細胞或豬睪丸細胞上培養，然后用CSF免疫熒光抗體法或免疫酶染法檢查，可檢測出細胞培養中細胞漿內的病毒抗原，亦可將分離的病毒回歸到健康豬體內，出現豬瘟的典型癥狀即可確診［3-4］。病毒分離鑒定方法特異性高，是診斷CSFV最為可靠的方法，但耗時較長、成本高，不易在臨床中推廣，比較適合科研院校研究用。

2.2血清學方法

2.2.1熒光抗體試驗（FAT）。熒光抗體試驗就是從高效價的特異性免疫血清提取IgG并熒光標記，然后利用抗原抗體特異性反應的原理，通過觀察是否有熒光出現來判斷是否有相應抗原存在的一種靈敏而又特異的診斷方法。豬瘟熒光抗體檢測是目前國內外實驗室診斷豬瘟最常用的方法。許多國家和地區將冰凍組織切片或觸片的直接熒光抗體試驗作為執行消滅豬瘟規劃的法定診斷方法。可用FAT直接檢測扁桃體、脾臟、腎臟和回腸遠端冰凍切片中的抗原，尤以發病早期的扁桃體的檢出率較高，也可將豬扁桃體和脾制成20g/L的混合勻漿后接種到無豬瘟病毒污染的豬源細胞（如PK-15）上，24～72h后進行飛片FAT試驗，檢查細胞中是否存在CSFV。此種病毒分離診斷方法比冰凍組織切片更為敏感。此試驗需要注意消除非特異性染色，設置已知陰性和陽性標本以及熒光抑制試驗等條件，以提高試驗的準確率。戴愛玲［5］利用熒光抗體技術對20頭不同病程的可疑病豬病料樣品進行檢測，結果表明該技術在豬瘟病毒感染早期的檢出率較高，不僅能檢出強毒抗原，還能檢出低毒力病毒感染的帶毒母豬。

2.2.2間接血凝試驗（IHA）。間接血凝試驗是利用CSFV或豬瘟免疫血清純化的IgG致敏綿羊紅細胞，將待檢血清或病原梯度稀釋后進行抗原抗體反應，根據紅細胞的凝集情況判斷結果。利用CSFV致敏綿羊紅細胞的間接血凝試驗稱為正向間接血凝試驗，利用豬瘟免疫血清純化的IgG致敏綿羊紅細胞的試驗則稱為反向間接血凝試驗。正向間接血凝試驗能夠直觀地測出抗體效價，具有簡便、快捷、易操作的特點，目前在基層中使用廣泛［6］，但不能區分是否為野毒感染。由于紅細胞容易產生血凝現象，診斷液還容易因為紅細胞處理不當而產生非特異性的血凝現象，所以在實際應用中容易出現結果偏差。反向間接血凝試驗能夠檢測組織病料如脾臟、淋巴結、扁桃體中的CSFV抗原，但由于對組織病料的處理方法有差異，而且組織中的血細胞易造成干擾和非特異凝集，使得結果判定困難，因而現在已很少應用。

2.2.3酶聯免疫吸附法（ELISA）。酶聯免疫吸附劑法是指將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或酶聯免疫測定儀判斷結果的一種方法［7］。該法敏感性強、特異性高、檢測速度快、易于標準化，是當前應用最廣的一項檢測技術。根據ELISA所用的固相載體不同可分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點ELISA（Dot-ELISA）；再一類是采用疏水性聚酯布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根據其性質不同分為間接ELISA、雙抗夾心ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。目前用于檢測豬瘟抗體的ELISA方法主要有間接ELISA和阻斷ELISA。蔣卉等［8］通過比較14種國內外豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的符合率，發現6種阻斷ELISA試劑盒的符合率均可達到100%，在敏感性和特異性上整體優于另外8種間接ELISA試劑盒。雙抗夾心ELISA法、夾心ELISA法及競爭ELISA法主要是檢測豬瘟病毒抗原［9-11］。

另外，有學者利用CSFV特異性單抗和ELISA原理建立了區分豬瘟強、弱毒的ELISA抗體檢測方法。丘惠深等［12］制備了CSFV石門株和弱毒疫苗株特異性單抗，并用親和層析法將兩種單抗分別制成單抗酶聯診斷試劑。強毒單抗酶聯診斷試劑可用于豬瘟的疫病監測，為凈化豬場提供依據；弱毒單抗酶聯診斷試劑可用于監測豬瘟疫苗免疫抗體，以準確評估群體免疫水平，考察豬群的免疫效果。這兩種單抗酶聯診斷試劑的應用，為豬瘟抗體的鑒別診斷奠定了基礎。鄭世軍等［13］、郭振梅等［14］、李育林等［15］、陳振華［16］都用該單抗酶聯試劑對臨床血清樣品進行了檢測，取得了較滿意的效果。

2.2.4膠體金免疫層析試驗。膠體金技術是20世紀80年代繼熒光標記、放射性同位素標記和酶標記三大標記技術后發展起來的固相標記免疫測定技術，具有操作簡單、方便快速、特異性強等優點，非常適合基層獸醫使用。其原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細層析作用，使抗原、抗體在固相膜上反應，以膠體金為標記物，陽性反應在膜上呈現紅色，陰性反應則不顯色。國內近年來也在豬瘟診斷上研究成功了許多診斷試紙條，如直接檢測豬瘟抗原的診斷試紙條和檢測豬瘟抗體的診斷試紙條。

2.3分子生物學方法自1983年KaryMullis發明聚合酶鏈式反應（PCR）以來，PCR技術就以其簡便、迅速、靈敏等優點在分子生物學等領域得到了迅速的發展和應用，同樣在豬瘟病毒檢測上也有了廣泛應用。比如RT-PCR技術、實時熒光定量PCR技術、環介導反轉錄等溫擴增技術等。RT-PCR是一種以病毒RNA為模板進行反轉錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法。陳本龍等［17］成功建立了一種能夠區分豬瘟病毒強毒株和HCLV株的RT-PCR檢測方法。該法從豬瘟強毒株和兔化弱毒株中擴增出了大小分別為680bp和785bp的特異性片段，具有高度的特異性和敏感性。實時熒光定量PCR是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，它融匯了傳統PCR技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點，為豬瘟病毒的定量檢測提供了新的分子生物學診斷技術。環介導等溫擴增（LAMP）方法是日本學者Notomi等在2000年發明的一項恒溫核酸擴增新技術，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經濟等特點，特別適合在現場和基層部門應用。張改平等［18］建立的豬瘟強弱毒LAMP檢測方法，特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1000倍，且重復性和穩定性良好，為快速準確地鑒別CSFV野毒感染和疫苗接種感染提供了有效的方法。

3　小結

目前豬瘟的流行已經由以前的大流行轉變成散發或地方性流行，發病日齡也逐漸變小，更嚴重的是種豬的隱性感染易導致豬瘟持續存在，加之易與其他疾病混合感染，使得豬瘟防控的任務十分艱巨。豬瘟弱毒疫苗在我國的大規模應用使得豬瘟強毒、疫苗弱毒的鑒別診斷成為有效防控豬瘟的攔路虎。雖然現在建立了許多鑒別強、弱毒的檢測方法，但能顯示出巨大發展潛力和廣闊應用前景的應該是基于單克隆抗體的膠體金免疫層析試驗。該方法具有簡單、快速，不需特殊儀器、可肉眼判別的優點，非常適合基層獸醫部門和廣大養殖戶使用。■

參考文獻：

［1］聶繼軍.一例溫和性豬瘟與豬偽狂犬病混合感染診治［J］.中國畜禽種業，2015，11（6）：79.

［2］寧宜寶，吳文福.我國豬瘟流行新特點與疫苗免疫研究［J］.中國獸藥雜志，2011，45（8）：33-37.

［3丘惠深.凈化是有效控制我國豬瘟的重要手段［J］.豬業科學，2010，27（3）：119.

［4］王天有，劉保國，趙恒章.豬傳染病現代診斷與防治技術［M］.北京：中國農業科學技術出版社，2005.

［5］戴愛玲.熒光抗體染色法檢測豬瘟的研究［J］.福建畜牧獸醫，2004，26（4）：9.

［6］張俊文.永靖縣規模養豬場豬瘟抗體檢測［J［.畜牧與獸醫，2013，45（8）：80-81.

［7］崔治中，崔保安.獸醫免疫學［M］.北京：中國農業出版社，2004.

［8］蔣卉，李翠，戴志紅，等.豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的比較試驗［J］.中國獸藥雜志，2015，49（6）：6-8.

［9］曹興萍，張以芳，何從忠，等.雙抗夾心ELISA法及熒光抗體法檢測豬瘟抗原的應用與分析［J］.中國獸醫雜志，2008（1）.

［10］湯賽冬，周雪芳，周光勝，等.檢測豬瘟抗原的夾心ELISA診斷試劑盒的制備、標化和應用的研究［J］.上海畜牧獸醫通訊，2002（2）.

［11］張富強，李志華，張念祖.競爭性ELISA檢測豬瘟病毒抗原［J］.中國獸醫雜志，2005（11）.

［12］丘惠深，王在時，廖國安.抗石門系豬瘟強毒淋巴細胞雜交瘤的研究［J］.中國畜禽傳染病，1990（1）：20-26.

［13］鄭世軍，甘孟侯.豬瘟強毒與弱毒感染血清抗體的檢測與分析［J］.中國獸醫雜志，1996，22（1）：17.

［14］郭振梅，遲慶賢，郭慶華，等.應用抗豬瘟強毒、弱毒單克隆抗體進行酶聯免疫吸附試驗對其疫情動態分析和免疫狀況的評估［J］.內蒙古獸醫，2001，69（3）：25-27.

［15］李育林，胡薛英，程國富，等.某豬場豬瘟強毒、弱毒抗體水平的檢測［J］.養殖與飼料，2002（4）：35-36.

［16］陳振華.利用單克隆抗體純化酶聯免疫吸附試驗檢測豬瘟自然感染和免疫抗體［J］.中國動物檢疫，2002，19（3）：33.

［17］陳本龍，張立懷，王建華，等.鑒別豬瘟病毒強毒和疫苗弱毒的RT-PCR檢測方法的建立［J］.中國動物檢疫，2013，30（11）：71-74.

［18］張改平，何文博，王德國，等.豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測 ［J］.鄭州大學學報（理學版），2014，46（3）：85-90.

中圖分類號：S852.651

文獻標識碼：A

文章編號：1001-8964（2016）06-0030-03

收稿日期：2016-05-05

作者簡介：陳強（1979-），男，廣西桂平人，助理獸醫師，本科，主要從事動物臨床、動物疫病預防控制工作。

Research on the Progress of Epidemiology and Diagnosis Method of Classical Swine Fever

CHEN Qiang1，LIANG Linan2
（1.Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station of Jiangkou Town in Guiping City，Guangxi Guiping 537229；
2.Ansheng Animal Science and Technology Limited Company in Yulin City，Guangxi Yulin 537000，China）

Abstract：In this paper，we reviewed the latest progress of epidemiology and diagnosis method of CSF，in order to provide a reference for animal epidemic prevention staffs understanding CSF.

Key words：Classical swine fever（CSF）；Epidemiology；Diagnosis method