超臨界流體萃取復方活血巴布膏中肉桂藥材的有效成分

畢建云， 劉善新， 梁瑞雪， 王 平*， 蘇 酩， 師 彬

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355；2.山東省中醫藥研究院，山東濟南250014；3.山東省醫學科學院附屬醫院，山東濟南250000）

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超臨界流體萃取復方活血巴布膏中肉桂藥材的有效成分

畢建云1，2， 劉善新2， 梁瑞雪2， 王 平2*， 蘇 酩2， 師 彬3

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355；2.山東省中醫藥研究院，山東濟南250014；3.山東省醫學科學院附屬醫院，山東濟南250000）

摘要：目的 優選復方活血巴布膏中肉桂藥材的超臨界流體萃取條件。方法 以桂皮醛得率為指標，正交試驗設計綜合考察了萃取壓力、萃取溫度和萃取時間等因素對藥材中有效成分得率的影響。結果 優選出的工藝條件為萃取壓力20 MPa，萃取溫度35℃，萃取時間2.5 h。結論 在該提取條件下，桂皮醛得率、提取率均較高，工藝穩定可靠。

關鍵詞：復方活血巴布膏；肉桂；桂皮醛；超臨界流體萃取；正交試驗設計

復方活血巴布膏為中藥復方制劑，具有溫經活血、祛風除濕、消腫止痛的功能，適用于寒濕阻痹型骨性關節炎，其主含揮發油的藥材為肉桂、川芎、芥子。其中，肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presi的干燥樹皮，具有補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈的功效，其主要揮發性成分桂皮醛對堿性磷酸酶ALP活力、鈣含量以及鈣化結節數量有明顯的促進作用，同時還具有明顯抗炎、除菌的效果［1-2］；川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，始載于《神農本草經》，其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣，祛風止痛之功效，其主要有效成分阿魏酸能抑制血小板TXA2的釋放，對其活性有直接的拮抗作用，具有抗凝活血功能［3］；芥子為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子，具有溫肺豁痰利氣，散結通絡止痛之功效。本實驗以桂皮醛得率為指標，采用超臨界流體萃取法來提取肉桂、川芎、芥子中的揮發油成分。

1 超臨界流體提取揮發油條件篩選

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 U1timate 3000高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、Chrome1eon7工作站（美國Thermo公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；HA220-50-06超臨界萃取裝置（江蘇華安科研儀器有限公司）。桂皮醛（批號FY1265VX53J，南通飛宇生物科技有限公司）。水為純凈水（美國Mi11ipore公司純水器制備）；所用試劑為色譜純或分析純。

1.1.2 藥材 所用藥材均購于山東百味堂中藥飲片有限公司，經山東省中醫藥研究院靳光乾研究員鑒定。

1.2 桂皮醛含有量測定［4-5］

1.2.1 色譜條件 Diamonsi1 C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（35∶65）；體積流量1 mL/min；檢測波長290 nm；進樣量10 μL；柱溫30℃。

1.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取含肉桂46.3 g的揮發油藥材120.25 g，粉碎（過50目篩），選擇萃取溫度為50℃，萃取壓力為30 MPa，萃取2.5 h，稱定收得揮發油的重量。然后，精密稱定揮發油0.1 g，置于25 mL量瓶中，定容至刻度，再精密吸取2 mL，置于25 mL量瓶中，定容至刻度，0.45 μm濾膜過濾，進樣10 μL。

1.2.3 空白溶液的制備 按處方比例，稱取除肉桂外的揮發油藥材，粉碎（過50目篩），樣品提取及制備方法同上，0.45 μm濾膜過濾，進樣10 μL。

1.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取桂皮醛9.58 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成質量濃度0.019 16 mg/mL的對照品溶液。

1.2.5 線性關系考察 取上述對照品貯備液適量，進樣0.5、2、4、8、10、15 μL，在“1.2.1”項色譜條件下進樣分析，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果，桂皮醛在0.009 580～0.287 4 μg范圍內有良好的線性關系，回歸方程Y=255.8X+0.081 50，相關系數r=0.999 9。

1.2.6 空白試驗 分別精密吸取對照品、供試品、缺肉桂空白對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在“1.2.1”項色譜條件下檢測。結果，對照品與供試品溶液在相同的保留時間處有相應的峰，而缺肉桂空白對照無干擾峰，說明該測定方法的專屬性好、無干擾，見圖1。

A.桂皮醛對照品 B.樣品 C.缺肉桂空白圖1　桂皮醛的HPLC色譜圖

1.2.7 精密度考察 分別精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，連續測定5次。結果，RSD為0.73％，表明儀器精密度良好。

1.2.8 穩定性考察 分別精密吸取供試品溶液10 μL，于0、2、4、8、12、24 h進樣。結果，RSD為1.19％，表明桂皮醛在24 h內穩定性良好。

1.2.9 重復性考察 精密稱取揮發油0.1 g，平行6份，按上述方法稀釋制備供試液，并測定桂皮醛的含有量。結果，RSD為0.80 ％，表明該方法重復性良好。

1.2.10 加樣回收率試驗 精密量取桂皮醛含有量已知的揮發油0.05 g，精密加入桂皮醛對照品，混勻，平行6份，按上述方法制備供試液，進樣10 μL。結果，桂皮醛平均回收率為99.14％，RSD為0.98 ％。

2 正交試驗優選超臨界流體萃取揮發油工藝路線［6-8］

2.1 因素與水平 選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時間作為考察因素，每種因素各取3個水平，再選用L9（34）正交表安排試驗，因素水平見表1。

表1　因素水平

2.2 試驗安排及結果 按處方比例稱取含肉桂46.3 g的水提取藥材120.25 g，按正交試驗表安排試驗，將桂皮醛的得率進行直觀及方差分析，結果見表2、表3。

表2　正交試驗結果

表3　正交試驗結果方差分析

直觀分析發現，桂皮醛得率各因素影響程度依次為C＞B＞A，但是后兩者相差不大；方差分析顯示，3個因素對揮發油萃取率的影響不顯著，萃取時間相對具有一定的影響，時間越長，提取得率越大。從省時節能的角度考慮，確定最佳提取工藝為A1B1C3，即萃取溫度35℃、萃取壓力20 MPa、萃取時間2.5 h。

2.3 驗證性試驗 采用上述優化條件，平行3次驗證試驗。結果，桂皮醛得率分別為18.98、18.40、18.89 mg/g，平均值為18.76 mg/g，RSD為1.68％；桂皮醛提取率分別81.10％、78.60％、80.13％，平均值為80.13％，RSD為1.68％，表明工藝條件穩定可行。

3 討論

超臨界流體萃取法常采用等溫減壓或等壓升溫的方法，將溶質與萃取劑分離開，從而避免了用煎煮、濃縮、干燥等傳統方法提取中藥有效成分時，一些活性組分因高溫而被破壞的弊端。它可在較低的溫度下進行，特別適合于熱敏性組分的提取，而且無溶劑殘留。文獻報道，采用超臨界流體萃取肉桂揮發油成分時，桂皮醛得率與本實驗結果相近［9］。本實驗發現，藥材中桂皮醛的含有量為2.3％，小試驗證中其提取率為80.13％，說明優選的條件能較完全地提取出藥材中的揮發油成分。為了后續試驗的方便進行，以及能最大程度提取阿魏酸等極性較大的成分，本實驗選擇加夾帶劑進行二次提取，并對二次提取液中桂皮醛的得率進行測定，發現其結果遠小于揮發油中該成分得率［10］，更進一步說明第一次就已經較完全地提取出肉桂藥材中的揮發油成分。

參考文獻：

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［2］ 趙美林，黃 萍，楊 霞，等.中藥桂皮醛體外抑菌和抗炎活性的研究［J］.廣東牙病防治，2008，16（10）：441-443.

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［10］ 宋浩亮，羅華菲，官洪義.阿魏酸及其制劑的穩定性研究［J］.安徽醫藥，2003，7（4）：252-253.

*通信作者：王 平（1974—），女，副研究員，碩士生導師，研究方向為中藥藥理學。Te1：（0531）82949847，E-mai1：wangpingjinan@163.com

作者簡介：畢建云（1987—），女，碩士，助理實驗員，研究方向為中藥新劑型與新制劑。Te1：15550486770，E-mai1：bjy1217@ 126.com。

基金項目：山東省自主創新成果轉化重大專項（2012ZHZX1C0405）；濟南市科技計劃（201219008）；濟南市青年科技明星計劃（20120142）

收稿日期：2014-09-02

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.046

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0191-03