內質網應激與氧化應激：惡性循環還是雙刃劍？

邱艷麗，李巧稚，鄭亞琴，李　倩

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內質網應激與氧化應激：惡性循環還是雙刃劍？

邱艷麗，李巧稚，鄭亞琴，李倩*

目的綜述內質網應激與氧化應激之間相互作用關系的研究進展。探討氧化應激與內質網應激相互作用誘發相關疾病的機制。方法閱讀國內外文獻數據庫中相關文獻，尤其是近年來關于氧化應激與內質網之間關系的文獻，結合臨床，從疾病誘發機制等方面對文獻進行整理和綜述。結果根據疾病背景，促進細胞存活的治療策略主要在于加強保護未折疊蛋白反應(UPR)信號響應，衰減內質網應激水平，或者滅活UPR促凋亡化合物；而從氧化應激出發，控制氧化應激水平，減弱內質網應激是控制疾病發作的重要方法。結論本文對兩種應激關系的研究近況進行整理總結，為相關疾病發病機制的深入研究和臨床應用提供理論依據。

內質網應激；氧化應激；相互作用

0　引言

內質網(Endoplasmic reticulum，ER)是一種存在于真核細胞中的細胞器，主要負責合成、折疊、修飾和轉運蛋白。此外，ER在保持固醇類、脂質類和碳水化合物生物合成及體內Ca2+平衡等方面也具有重要作用。只有正確的折疊蛋白才能從ER轉運至高爾基體中。任何干擾氧化還原的調控都能夠導致內質網應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)，其中未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)是細胞內的信號傳導途徑，調節ER蛋白質折疊，會導致錯誤折疊，改變蛋白質穩態。研究表明，ER蛋白質氧化的副產物中蛋白質折疊和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生有密切聯系。氧化應激(Oxidative stress，OS)時，UPR激活是一個自適機制，以維護細胞的功能和存活。持續OS和蛋白質錯誤折疊會引起凋亡級聯，在多種疾病(包括糖尿病、動脈粥樣硬化和神經系統變性疾病的發病機制中發揮主導作用)，然而，ERS誘發疾病的發病機制仍不明確，研究表明其與OS有關。本文對ERS與OS之間相互作用誘發疾病的相關機制作初步概述，現報道如下。

1　內質網應激

內質網修飾蛋白的常見方法包括N-糖基化、二硫鍵形成和低聚，此過程需要分子伴侶。常見的分子伴侶包括：蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)、ERp29、熱休克蛋白70家族成員(BiP/GRP78)、鈣聯接蛋白(CRT)、鈣網蛋白和肽基異構酶家族[1]。ERS可以與OS、炎癥反應及蛋白質合成降解等多種信號通路偶聯，通過偶聯下游的多種信號分子對細胞的代謝、氧化和抗氧化、蛋白質合成和降解、增殖與凋亡、炎癥反應等生理病理活動進行調控[2]。因此，ER是細胞質量控制的檢查點。常見的ERS主要激活3條信號通路：UPR、超負荷反應(Endoplasmic reticulum overload response，EOR)和固醇調節級聯反應。在真核細胞中，UPR被3個ER跨膜蛋白激活：PERK(雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶)、IRE1(需肌醇酶1)和ATF6(激活轉錄因子)。在非應激和正常的生理條件下，這些蛋白處于不活躍的狀態，與ER的分子伴侶BIP/GRP78相結合。當ER應激時，BIP/GRP78與3個ER跨膜蛋白解離，導致UPR激活[3]。ERS后可引起內質網腔中錯誤折疊和未折疊蛋白的聚集，破壞內質網內Ca2+動態平衡。在轉基因小鼠的研究中發現，UPR途徑與許多生理過程和疾病相關[4-5]，引起人們關注[6]。

2　氧化應激

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如ROS和活性氮自由基(Reactive nitrogen species，RNS)產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。即體內氧化與抗氧化系統失衡，傾向氧化，導致中性粒細胞炎性浸染，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物。細胞中ROS的內源性來源主要為線粒體電子傳遞鏈(mETC)，有氧呼吸的過程中，正常情況下，O2主要在線粒體呼吸鏈末端氧化酶的作用下還原成H2O，只有少量O2-(2%～3%)從電子傳遞鏈上泄露出來，但在病理狀態時，會有大量O2-泄露出來。除mETC外，低水平ROS是由膜定位的NADPH氧化酶(NoX)、過氧化物酶和細胞色素P450系統產生的[7-10]。

3　內質網應激與氧化應激的關系

3.1氧化應激引起內質網應激

3.1.1ROS和UPRUPR是指由于缺氧缺血、OS等因素引起ERS時，應激信號由ER傳到細胞核中，繼而引發一系列特定的靶基因和蛋白質翻譯水平下降，以維持細胞正常功能的一種自我保護機制。但當EOS過強時，ER的功能紊亂得不到修正，造成UPR超載，即細胞啟動細胞凋亡程序，最終可能導致細胞壞死和組織損傷。

3.1.2ROS和超負荷反應PDI是內質網腔內保證正確折疊蛋白的一類酶，其功能為催化二硫鍵的形成和構建二硫鍵的重排。ER是細胞的鈣存儲器，參與鈣穩態和鈣介導的信號途徑。新生成的蛋白質在ERS內適當折疊，其成熟和定位都需要ER高度氧化和豐富的鈣環境。ER高度氧化和豐富鈣環境對于蛋白質翻譯修飾(包括糖基化和二硫鍵的形成)是必要的[11]。目前研究表明，ROS對蛋白質折疊二硫鍵形成的作用有2種機制。①二硫鍵的形成是由EOR1、穩定的FAD依賴酶和PDI所決定的。在二硫鍵的形成過程中，PDI接受從多肽底物半胱氨酸殘基的2個電子，轉給ERO1，啟動了另一個二硫鍵循環途徑[12]。ERO1從PDI接受電子后傳遞給分子氧，同時產生H2O2，后者成為ER腔中主要的ROS。ROS生成蛋白質錯誤折疊導致谷胱甘肽(GSH)消耗，使GSH被氧化生成氧化谷胱甘肽(GSSH)。真核細胞中的非蛋白硫醇具有抗氧化功能，可修復GSH和ERO1/PDI之間的關系，使GSSH還原為GSH。GSH和GSSH之間的平衡對于細胞的氧化還原穩態的維持是至關重要的。GSH/GSSH比率的串擾導致錯誤蛋白質的折疊和ROS生成增加[13-14]。在蛋白質錯誤折疊的過程中，二硫鍵的斷裂和形成是一個重復的周期，每個周期中都會產生ROS副產物。GSH消耗的同時，ER中的UPR接受線粒體產生ROS，導致細胞死亡。②ROS的生成獨立于二硫鍵的形成。在ER中，未折疊蛋白的積累導致Ca2+泄露進入細胞液中，增加了線粒體中ROS的產生。兩種機制最終導致線粒體ROS的產量增加，影響線粒體電子傳遞鏈生成ATP。因此，ROS的生成和OS可以視為UPR的有機組成部分。即ROS生成可以在UPR反應中的上游和下游起作用，證明ERS和OS相互作用[15]。

3.1.3ROS是觸發內質網應激介導凋亡通路的上游信號分子研究表明，ER應激對于細胞凋亡起重要作用。有報道，CHOP是ER應激反應在細胞凋亡方面起作用的重要因素，能誘導和上調UPR的3條信號通路。誘導的適應性反應稱為UPR，3種主要應激信號控制UPR依賴性反應，包括IRE1α、PERK和ATF6。ER跨膜轉換因子可恢復蛋白的折疊能力。激活的IRE1α 特異性地剪切核苷酸基因內區的mRNA編碼轉錄因子XBP1，促進XBP1轉錄和表達，進而上調UPR。IRE1α可促進激活ASK1(凋亡信號激酶1)，激活下游應激激酶Jun-N終端激酶(物)和P38 MAPK，促進細胞凋亡[16-17]。最近，關于果蠅和鼠的細胞研究顯示，RIDD減少ER胞漿中的mRNA。RIDD選擇性目標信使RNA編碼的蛋白質參與蛋白質折疊，持續激活RIDD能夠促進細胞死亡，整個過程與IRE1α構象相關[18-19]。ER、OS通過產生ROS，可能增加內質網腔內鈣的泄漏，通過多種機制刺激線粒體活性氧的生產。線粒體ROS量主要反映泛半醌自由基中間體QH.量，復合物Ⅲ受抑制時QH.增加。線粒體內產生的高濃度ROS進一步促進ER內鈣的釋放，線粒體內鈣的積累可增加線粒體活性氧的產生，導致通透性轉換孔開放。此外，在ER膜，ROS可反饋給敏感的鈣釋放通道。如：通過活性氧或活性氮氧化蘭尼堿受體中關鍵的巰基，并導致其失活，從而增加了鈣從肌漿網的釋放。隨著細胞抗氧化電位的減少，鈣釋放的惡性循環與ROS生成使細胞存活更加受到威脅[20]。

3.2內質網應激誘發氧化應激一方面，ERS可通過UPR以及與線粒體之間的相互作用產生過多的ROS分子，如O2-、OH-等，誘導局部組織和細胞的OS；另一方面，ERS可通過自身跨膜蛋白相關途徑的活化而激活抗氧化轉錄因子，上調眾多抗氧化酶的表達，均可對抗OS，維持細胞內環境氧化/抗氧化的平衡[21-23]。ROS高水平沉積能夠導致蛋白損傷，進一步導致ERS。內質網在胞內蛋白折疊和修飾中起重要作用，ROS水平過高明顯誘導內質網中蛋白的錯誤折疊，激發ERS。反之，延長ERS可以誘導ROS產生[24-26]。

3.3氧化應激與內質網應激相互作用所涉及通路

3.3.1PERK-eIF2α通路PERK屬于Ⅰ型內質網跨膜蛋白，包括在內質網腔中的N端和在胞質中的C端。當ROS進入內質網并直接進攻蛋白折疊酶上游離的巰基，可使ER腔內未折疊蛋白質增多，進而誘導免疫球蛋白結合蛋白(Immunoglobulin-binding protein，BiP)和PERK解離，結合未折疊的蛋白質，減少ER中未折疊蛋白的積累。解離的PERK形成寡聚物并發生自身磷酸化和二聚化。活化的PERK使底物eIF2α (Eukaryotic translation initiation factor-α)特異性磷酸化，失去啟動蛋白質翻譯的能力[27-28]。

3.3.2IRE1α-XBP1通路IRE1α屬于內質網中的Ⅰ型跨膜蛋白，哺乳動物細胞中有2個Ire1P 同源物：Ire1α、Ire1β。Ire1α在各組織細胞中廣泛存在，而Ire1β僅存在于消化道上皮細胞，兩者均具有與Ire1P相同的3個功能域[29]。IRE1α在細胞中廣泛存在，正常情況下，IRE1α與內質網中的分子伴侶BIP/GRP78結合，而當ROS誘發內質網中未折疊蛋白的蓄積引發ERS時，誘導ER膜上IRE1α胞漿的結構域低聚和自身磷酸化而被激活。激活的IRE1α特異地剪切核苷酸基因內區的mRNA編碼轉錄因子XBP-1，促進轉錄因子XBP-1s (X-box binding protein-1 splicing)轉錄[30]。

3.3.3ATF6通路ATF6是真核細胞內質網膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，在哺乳動物細胞中有2種亞型：ATF6α、ATF6β[11,31]。ATF6由Ire1α、Ire1β活化，使XBP-1mRNA的內含子被剪接，從而翻譯成轉錄因子。ATF6過表達能夠激活哺乳動物細胞中的未折疊蛋白反應的相關靶點。內質網內腔中的ATF6與Ire1、GRP78相互作用，在ATF6上組合形成高爾基體定位的信號序列。當ROS誘發內質網中未折疊蛋白的蓄積引發ERS時，ATF6與GRP78分離，暴露高爾基體定位信號序列，介導ATF6進入高爾基體，在高爾基體內ATF6被S1P、S2P蛋白酶裂解，N末端bZIP結構域從膜上脫落進入胞核，從而激活轉錄因子XBP-1和其他折疊蛋白反應靶基因，引發UPR[32]。

3.3.4三條通路的結合作用通常，哺乳動物中UPR的傳導激活機制是受限制的。但在酵母菌中，已有IRE1的直接識別機制。而哺乳細胞中，體外研究表明，IRE1α激活的直接識別機制尚不明確。近期報道顯示，在哺乳細胞中，IRE1β可能直接綁定未折疊蛋白，和酵母中IRE1相似。綁定和分離BiP作為ER應激激活信號。在慢性ER應激條件下，如：ATF4的誘導及其下游的目標CHOP導致凋亡，可能通過Bcl-2家族促細胞凋亡轉錄。GADD34表達可能使細胞敏感死亡，其在應激細胞中恢復細胞的形成。IRE1α激活也會通過2個不同的機制參與細胞的死亡過程：①激活ASK1、JNK；②持續的RIDD。在ER中，過多的活性氧的產生和鈣離子的釋放可導致細胞不可逆的損傷。在信號行為之間的顯著差異可能使XBP1表達保護影響消失，增強ATF4和CHOP下游細胞的凋亡[13]。

4　氧化應激和內質網應激相互作用，互為因果

有研究顯示，在胸腺癌細胞中，白蘞素(AMP)會增加ROS的產生，誘導由ERS產生的GRP78和CHOP的表達。ROS清除劑NAC阻斷ROS產生時，大大降低了AMP誘導的GRP78和CHOP的表達，說明ROS的生成拮抗了由AMP誘導的ERS的上游物質。通過RNA干擾，對抗CHOP產生的UPR通路，明顯抑制了ROS的產生。表明AMP誘導的ROS能誘發下游的UPR激活和ER應激，增加ROS的產量。雖然準確的潛在機制尚不明確，但研究表明，OS和ERS可能會形成惡性循環[16]。

所有細胞器中均可以產生ROS，最終導致蛋白質損害。此外，生物系統暴露于各種OS條件下會導致細胞水平的氧化修飾蛋白、脂質和核酸增加，隨后誘發疾病發展，引起認知功能和代謝完整性受損。研究表明，蛋白質折疊和ROS的產生密切相關，如內質網應激可以引起ROS的生成，氧化應激可以通過引起UPR反應，保護細胞功能，并維持其存活。另外，神經學研究表明，6-羥基多巴胺引起的氧化可能會引起內質網應激或UPR，最終導致細胞死亡。氧化應激與內質網應激作用可以互為因果[33]。發生在ER中的氧化蛋白質折疊以及蛋白質折疊擾動會引起損害，改變氧化還原狀態；活性氧的產生可直接或間接(或兩者)影響ER穩態和蛋白質折疊。結果表明，OS和氧化蛋白質折疊之間的關系可能為今后研究的主要領域[34]。

5　總結

在多種疾病中，ER功能障礙是重要的影響因素，可調節細胞存活和細胞死亡的機制。根據疾病背景，促進細胞存活的治療策略可能包括加強保護UPR信號響應，衰減ER應激水平，或者滅活UPR促凋亡化合物；而從OS出發，控制OS水平、減弱ERS是控制疾病發作的重要方法。目前，ERS和OS的相互作用機制尚不明確。需要進一步研究其對體內蛋白質折疊、錯誤折疊和分泌的影響，闡明蛋白質錯誤折疊可能導致OS及細胞凋亡的機制；針對此領域的深入研究有助于理解ERS和OS的相互作用，及其如何被整合到其他細胞信號途徑中；對蛋白質錯誤折疊和OS之間關系的研究可促進藥物制劑的發展；加強ERS和OS信號途徑機制的理解，可能有助于相關疾病的選擇性、特異性藥物的開發。

[1]Ashraf NU,Sheikh TA.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[J].Free Radic Res,2015,49(12):1405-1418.

[2]羅志鋒.內質網應激偶聯氧化應激信號通路在糖尿病腎病發病中的作用[D].重慶：第三軍醫大學,2011.

[3]Dong ZG,Zhang Y,Xun QU.Endoplasmic reticulum stress within hypoxia microenvironment and its related dieases[J].Basic & Clinical Medicine,2009,29(6):649-653.

[4]Wang S,Kaufman RJ.The impact of the unfolded protein response on human disease[J].J Cell Biol,2012,197(7):857-67.

[5]Bommiasamy H,Popko B.Animal models in the study of the unfolded protein response [J].Methods Enzymol,2011,491:91-109.

[6]Schr?der M,Kaufman RJ.The mammalian unfolded protein response[J].Annu Rev Biochem,2005,74(74):739-789.

[7]于春艷.內質網應激—自噬反應在維生素K3誘導人宮頸癌細胞氧化應激損傷中的作用[D].長春:吉林大學,2010.

[8]Kanwar YS,Wada J,Sun L,et al.Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression[J].Exp Biol Med (Maywood),2008,233(1):4-11.

[9]Tan AL,Forbes JM,Cooper ME.Age,rage,and ROS in diabetic nephropathy[J].Semin Nephrol,2007,27(2):130-143.

[10]Inoguchi T,Sonta T,Tsubouchi H,et al.Protein kinase c-dependent increase in reactive oxygen species (ros) production in vascular tissues of diabetes:role of vascular nad(p)h oxidase[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(8 Suppl 3):S227-S232.

[11]Creighton TE,Hillson DA,Freedman RB.Catalysis by protein-disulphide isomerase of the unfolding and refolding of proteins with disulphide bonds[J].J Mol Biol,1980,142(1):43-62.

[12]Pollard MG,Travers KJ,Weissman JS.Ero1p:a novel and ubiquitous protein with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum[J].Mol Cell,1998,1(2):171-182.

[13]Malhotra JD,Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress:a vicious cycle or a double-edged sword[J].Antioxid Redox Signal,2007,9(12):2277-2293.

[14]Cao SS,Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease[J].Antioxid Redox Signal,2014,21(3):396-413.

[15]Higa A,Chevet E.Redox signaling loops in the unfolded protein response[J].Cell Signal,2012,24(8):1548-1555.

[16]Ken A,Sun-Ryung L,Klaus VL,et al.Involvement of ERK MAP kinase in endoplasmic reticulum stress in SH-SY5Y human neuroblastoma cells[J].J Neurochem,2004,89(1):232-239.

[17]Urano F,Wang X,Bertolotti A,et al.Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase IRE1[J].Science,2000,287(5453):664-666.

[18]Yanjun M,Brewer JW,J Alan D,et al.Two distinct stress signaling pathways converge upon the CHOP promoter during the mammalian unfolded protein response[J].J Mol Biol,2002,318(5):1351-1365.

[19]Novoa I,Zeng H,Harding HP,et al.Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2alpha[J].J Cell Biol,2001,153(5):153-1011.

[20]Berridge MJ.The endoplasmic reticulum:a multifunctional signaling organelle[J].Cell Calcium,2002,32:235-249.

[21]Malhotra JD,Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress:a vicious cycle or a double-edged sword[J].Antioxid Redox Signal,2007,9(12):2277-2293.

[22]Austin RC.The unfolded protein response in health and disease[J].Antioxid Redox Signal,2009,11(9):2279-2287.

[23]Zhang K,Kaufman RJ.From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response[J].Nature,2008,454(7203):455-462.

[24]Pierre AS,Minville-Walz M,Fèvre C,et al.Trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid induced cell death in human colon cancer cells through reactive oxygen species-mediated ER stress[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2013,1831(4):759-768.

[25]Malhotra JD,Kaufman RJ.The endoplasmic reticulum and the unfolded protein response[J].Semin Cell Dev Biol,2007,18(6):716-731.

[26]Abuaita BH,Burkholder KM,Boles BR,et al.The Endoplasmic Reticulum Stress Sensor Inositol-Requiring Enzyme 1α Augments Bacterial Killing through Sustained Oxidant Production[J].MBio,2015,6(4):e00705.

[27]Zu K,Bihani T,Lin A,et al.Enhanced selenium effect on growth arrest by GRP78/BIP knockdown in p53-null human prostate cancer cells[J].Oncogene,2006,25 (4):546-554.

[28]董召剛,張巖,曲迅.低氧微環境下內質網應激及其相關疾病[J].基礎醫學與臨床,2009,6:649-653.

[29]Hampton RY.IRE1:a role in UPREgulation of ER degradation[J].Dev Cell,2003,4(2):144-146.

[30]Koong AC,Chauhan V,Romeroramirez L.Targeting XBP-1 as a novel anti-cancer strategy[J].Cancer Biol Ther,2006,5(7):756-759.

[31]Kaufman RJ,Scheuner D,Schroder M,et al.The unfolded protein response in nutrient sensing and differentiation[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(6):411-421.

[32]劉寶琴,王華芹.內質網應激與未折疊蛋白反應的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志,2010,11:869-872.

[33]Yamamuro A,Yoshioka Y,Ogita K,et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress on the cell death induced by 6-hydroxydopamine in human neuroblastoma SH-SY5Y cells[J].Neurochem Res,2006,31(5):657-664.

[34]Stadtman ER.Importance of individuality in oxidative stress and aging[J].Free Radic Biol Med,2002,33:597-604.

Interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress

QIU Yan-li,LI Qiao-zhi,ZHENG Ya-qin,LI Qian*

(College of Pharmacy,Harbin Medical University,Harbin 150081,China)

ObjectiveTo summarize the research progress in the interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress.MethodsResearch articles about the interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress were reviewed and summarized according to clinical use and disease mechanisms.ResultsTreatment strategies that promoted cell survival mainly focused on strengthening the protection of UPR response signal,attenuating ER stress level,or inactivating UPR pro-apoptotic compound according to the disease.Regulating oxidative stress level and weakening ERS was an important method to control the disease from the aspect of oxidative stress.ConclusionThis paper summarizes the researches in interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress,providing theoretical evidence for the research in diseases-related pathogenesis and further clinical application.

ER stress;Oxidative stress;Interaction

2016-04-26

哈爾濱醫科大學藥學院，哈爾濱 150081

國家自然科學基金(31100835)；黑龍江省科學基金資助面上項目 (12015-65/H2809)；中國博士后面上基金資助(2013M531066)；黑龍江省博士后資助 (LBH-Z11059)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608030