孫培龍 陶文揚 何晉浙(浙江工業大學,浙江 杭州 310000)
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靈芝中三萜類化合物的研究進展*
孫培龍陶文揚何晉浙
(浙江工業大學,浙江 杭州 310000)
摘要靈芝歷來被認為是滋補強身、扶正固本的神奇珍品。近年來對靈芝的狂熱研究發現其具有多種藥理活性,在醫藥、保健和食品各領域都有很好的發展前景。靈芝富含三萜類化合物,是靈芝中十分重要的藥理藥效成分,對靈芝三萜類化合物的研究報道日漸增多。本文綜述了靈芝中三萜類化合物對藥理藥效的貢獻及其研究進展。
關鍵詞靈芝;三萜類;研究進展
*本文為由中國食品土畜進出口商會、浙江省龍泉市人民政府、浙江省中藥材產業協會、浙江省食用菌協會于2015 年8月在浙江龍泉聯合主辦的第一屆中國靈芝大會的會議發言稿,經組委會同意,在本刊正式發表。
靈芝在我國已有2 000多年的藥用歷史,被歷代醫藥家視為滋補強壯、扶正固本的神奇珍品,主要分布在中國、朝鮮、韓國等亞洲國家,2000年版的《中國藥典》首次承認了靈芝的藥用價值。目前,已被開發的靈芝產品主要有靈芝多糖、靈芝孢子粉、靈芝孢子油等,而單純的靈芝三萜類的產品卻未見報道。
靈芝中的三萜類成分主要分布在子實體的外周部分,含量隨子實體成熟度的提高而遞增。三萜類化合物有些很苦,有些無苦味,其含量因品種、培養條件和不同生育階段含量有所差別,苦味的靈芝其三萜類化合物含量一般較高。近年來的研究發現,靈芝三萜類成分具有多種藥理活性,使其越來越受到研究者的重視,研究日益深入,相關文獻日漸增多。
1982年Kubota T.等首次從赤芝子實體中分離獲得靈芝三萜類化合物[1]。根據靈芝三萜化合物分子中所含的碳原子數,分為C30、C27和C24三大類[2]。三萜類化合物多為四環三萜和五環三萜,鏈狀、單環、雙環和三環三萜較少。四環三萜常見的結構類型有達瑪烷型、環阿屯烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、葫蘆烷型;五環三萜主要包括齊墩果烷型、羽扇豆烷型、何伯烷型、烏蘇烷型和木栓烷型[3]。
靈芝三萜類化合物是一類高度氧化的羊毛甾烷衍生物,存在于靈芝的中性組分和酸性組分中,在脂質中溶解度較高。靈芝三萜類化合物結構中一般都含有羥基,且在紫外光譜中呈現多個波長的吸收特征,這一特點為靈芝三萜類成分的研究提供了方便。其中,靈芝酸作為靈芝三萜類化合物中重要的活性成分,根據官能團和側鏈的差異,又可分為靈芝酸、靈芝內酯、靈芝醇、赤芝酸等基本骨架[4]。不同的側鏈連接點對三萜類物質的活性有不同的影響,Fatmawati S.等研究表明,C11位的官能團對其藥理作用的影響較大,并且C3、C7和C15位所連接的羥基取代基對醛糖還原酶的抑制作用很重要[5]。
2.1常規溶劑提取法
靈芝三萜類化合物結構相似,難溶于水,易溶于有機溶劑,較不穩定,因此難以分離和純化。常采用甲醇、乙醇、氯仿或乙酸乙酯等有機溶劑在常溫或高溫下回流提取。不同溶劑、濃度、提取環境對提取效果有明顯影響。楊德等探究乙醇濃度對靈芝三萜類成分的提取率的關系,發現其與乙醇濃度呈正相關關系[6]。侯敏娜等采用正交試驗方法探究了靈芝三萜的最佳提取方法,得出最佳的提取工藝為5倍量95%乙醇回流提取3次,每次1.5 h,最后得到產物的總三萜類含量為9.07%[7]。Fatmawati S.等將靈芝子實體在室溫下用氯仿提取3次,浸泡24 h,所得浸膏經堿提酸化后再由氯仿萃取得到三萜酸浸膏,提取率為1.99%[8]。
2.2超聲輔助提取法
從靈芝子實體或孢子粉中提取三萜類物質時,溶劑回流提取法因受其結構影響,花費時間較長,而采用超聲波處理破壞靈芝的致密結構,可縮短提取時間一半以上[9],目前已得到廣泛應用。Keypour S.等和Liu Y.L.等采用超聲波輔助提取,以氯仿為提取溶劑,提取液過濾后濃縮得三萜類浸膏,其提取率在1%~1.5%[10,11]。黃曉巧等人研究了靈芝三萜類成分超聲提取的最佳條件,發現最佳提取工藝是加40倍量甲醇,超聲提取3次,每次30 min[12]。
2.3微波輔助提取法
微波提取技術是近年來發展起來的新型提取技術,具有選擇性強、耗時少、能耗低、排污量少等優點,是目前天然產物提取的創新技術。該技術利用產生的高頻電磁波,穿透組織外層結構而迅速到達組織內部,使組織內部溫度和壓力迅速升高,導致細胞破裂,有效成分自由流出。盧彥芳等設計微波連續抽提的方法,并與其他傳統提取方法進行比較,發現微波連續抽提和常規的微波萃取分別需要14.5 min和10 min即可達到靈芝三萜類成分的最大提取量,而其他非微波提取的常規方法則需要幾十分鐘甚至上百分鐘,且微波連續抽提所得產物的純度遠遠高于其他方法[13]。
2.4超臨界萃取法
超臨界CO2提取(supercritical fluid carbon dioxide extraction)技術是一項把萃取和分離合二為一的新型技術,該技術與傳統的化學溶劑提取法相比,不僅工藝簡單、能耗低,活性成分不易被破壞,而且具有無污染、無化學溶劑消耗和殘留的優點,被稱為綠色生物萃取分離技術。高宇杰等嘗試使用超臨界CO2提取法萃取靈芝三萜類成分,并用正交試驗獲得最佳萃取分離條件為:萃取壓力30 MPa,萃取溫度40 ℃,壓力8 MPa,溫度56 ℃,在此條件下靈芝三萜類成分的得率為38.14 g/kg[14]。賈曉斌等人比較了超臨界CO2流體萃取法和醇回流提取法提取效果的優劣,發現這兩種方法得到的三萜類成分的色譜圖具有相似的峰形,靈芝三萜和靈芝酸B含量相近,而固形物含量則以醇回流法為高[15]。
3.1抗腫瘤作用
靈芝可以通過抑制腫瘤細胞的分裂與增殖、促進腫瘤細胞死亡、抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移、調節免疫系統,以及輔助常規治療等方法發揮抗腫瘤作用[16]。Liu R.M.等從靈芝發酵菌絲中分離得到一對位置異構體:靈芝酸Mf和靈芝酸S,隨后的MTT實驗表明,二者均能夠抑制人體的多種癌細胞株的增殖[17]。劉峰等探究靈芝三萜類物質在小鼠體內的腫瘤抑制能力,發現靈芝三萜組分GLE對S180肉瘤小鼠及前期研究的H22肝癌小鼠體內具有一定的抗腫瘤作用[18]。
Nguyen V.T.等人從越南靈芝中分離出了兩類新的三萜類化合物,其中一種對PC-3細胞有明顯的抑制作用,而已發現的16種三萜類化合物中有一種表現出了強有力的阻礙血管生成的能力[19]。
3.2抗炎作用
Dudhgaonkar S.等研究發現,靈芝三萜能夠抑制由脂多糖(LSP)引起的各種炎癥反應[20]。Ko H.H.等從赤芝和松杉靈芝中共分離獲得12種三萜類和甾醇類化合物,其中化合物10通過FMLP/細胞松弛素B(CB)的刺激,對大鼠中性粒細胞甲酰基β-葡萄糖醛酸酶的釋放有明顯的抑制作用;化合物9還可以防止紫外線對人類角質形成細胞B(UV-B)造成的光損傷,從而可以保護細胞免受光損傷[21]。
Hasnat M.A.等研究發芽的糙米上長出的靈芝的生理活性情況,通過免疫熒光法發現,其可抑制結腸炎小鼠的NF-kB通路;而通過免疫組織化學著色法發現了COX-2和IL-1β的表達,最后的動物學實驗表明,這類靈芝的三萜類提取物可以顯著緩解結腸炎小鼠的病情[22]。
Choi S.等發現,從靈芝RAW264.7細胞中提取的三萜類成分可以通過AKT-Nrf2通路對血紅素氧合酶-1施加影響,為靈芝三萜類成分的抗炎能力的機制提出了一個新的研究方向[23]。
3.3護肝作用
黃宗銹等采用經典的CCl4模型,同時給予動物低、中、高劑量的靈芝三萜,通過血清生化指標的檢測,發現靈芝三萜能夠明顯抑制CCl4引起小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的升高,此外靈芝三萜還能使肝臟組織形態學上的肝細胞變性、壞死程度得到明顯的改善和恢復,表明靈芝三萜類成分對CCl4引起的肝臟損傷有較好的保護作用[24]。鮑琛等發現,靈芝三萜類成分對高脂飼料所致非酒精性脂肪肝小鼠具有保肝調脂作用,其高、中劑量的靈芝三萜類成分都明顯表現出了對肝臟的保護作用,可以降低非酒精性脂肪肝小鼠肝臟中TG、TC、丙二醛(MDA)含量,提升超氧化物歧化酶(SOD)的活力,且通過組織病理學檢查后發現,小鼠脂肪肝程度和肝細胞壞死程度有明顯減輕[25]。
Liu L.Y.等從茶病靈芝中提取了10類三萜類成分,其中有5種是新發現的三萜類,且有6類在細胞學試驗中表現出了護肝作用,保護了HL-7702細胞不被DL-半乳糖胺誘導產生細胞損傷[26]。
3.4抗病毒作用
Min B.S.等從赤芝孢子粉中分離得到了靈芝酸,體外試驗表明其對HIV-1蛋白酶活性有明顯抑制作用,其IC50為20 μmol /L[27]。
Sato N.等研究表明,從赤芝與紫芝中提取分離得到的三萜類物質,對HIV-1病毒、HIV-1蛋白酶均有一定的抑制作用。赤芝中的靈芝酮三醇和靈芝醇F可抑制由HIV-1誘導的MT24細胞的細胞毒性效應。在抗HIV-1 蛋白酶實驗中,赤芝中的靈芝酸B和靈芝醇B對HIV-1蛋白酶的活性有較強的抑制作用,從紫芝中分離到的靈芝酸GS-2、20-羥基赤芝酸N、20(21)-二羥基赤芝酸N和靈芝醇F對HIV-1蛋白酶的活性也有一定的抑制作用,IC50在20~40 μmol /L[28]。
Zhang W.等發現,Lanosta-7,9(11),24-trien-3-one,15;26-dihydroxy (GLTA) 和Ganoderic acid Y (GLTB)兩類靈芝酸可以抑制腸病毒71對人體的感染,通過與腸病毒71反應來阻止腸病毒71吸附正常細胞,進而保護人體免受腸病毒71的侵害[29]。
3.5抑菌作用
靈芝三萜類化合物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌都有一定的抑制作用。劉高強等人對靈芝三萜類成分的抑菌能力進行研究后發現,赤芝發酵菌體中的三萜類化合物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及青霉、黑霉均有明顯的抑制作用,其最小抑菌濃度分別為25 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL[30]。Li W.J.等通過液-質聯用方法,從黑芝中分離獲得8種靈芝酸,經體外抑菌試驗發現,8種靈芝酸對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌和大腸桿菌均有明顯的抑制作用,在抗菌制劑應用方面有潛在的藥用價值[31]。
3.6抗氧化能力
劉丙進等研究發現,靈芝三萜類化合物可能通過增強機體清除氧自由基的能力和抗氧化功能,減輕自由基的損傷效應,減少脂質過氧化反應的發生和脂質過氧化產物的生成,維持細胞內環境的穩定,從而起到保護細胞,延緩衰老的作用[32]。周曉等人通過DPPH法和羥自由基清除法研究靈芝三萜類成分的抗氧化能力,發現靈芝三萜類具有較強的抗氧化能力,且隨著濃度的增加而變強,而經超聲輔助提取法獲得產物的抗氧化能力要高于傳統浸提法[33]。
3.7其他
(1)減少哮喘。Liu C.等發現,靈芝酸C1可以減少哮喘病人的外周血單核細胞產生的LPS誘導的TNF-α,或能為哮喘治療提供一個新的研究方向[34]。
(2)治療皮膚凍傷。Shen C.Y.等制造了基于納米脂質載體的外用靈芝三萜類膠體,其可用于治愈皮膚凍傷,且效果明顯高于無載體靈芝三萜類膠體[35]。
(3)抗輻射。Smina T.P.等評估了靈芝中三萜類成分阻止γ輻射誘發的小鼠肝細胞線粒體和微粒體膜損傷的能力,以及用于體內間接療法治療pBR322質粒DNA受γ輻射引起的DNA斷裂的可能性,結果表明靈芝三萜類成分可以有效防止由輻射引起的膜損傷和DNA的斷裂[36]。
(4)抗瘧原蟲。Ma K.等從靈芝中提取了9類三萜成分,其中的1、2、6成分具有較好的抗瘧原蟲能力,而5、7、8、9成分會與LXRβ產生競爭效果,其EC50值分別為203.00 nM、8.32 nM、257.00 nM、86.70 nM[37]。
(5)降血糖。Ma H.T.等通過動物實驗發現,靈芝三萜類成分可以通過抑制糖醛還原酶與α-葡糖苷酶的活性,進而抑制餐后的血糖上升,可以作為糖尿病癥的輔助藥劑[38]。
隨著對靈芝活性成分的研究越來越深入,對靈芝三萜類化合物的結構與藥理藥效也越來越清楚,但是,科學家們對靈芝三萜類化合物在人體中的作用機理機制還不是很清楚,這大大限制了靈芝三萜類化合物的應用。根據多年的前沿跟蹤調研,筆者認為今后一個階段對靈芝三萜類化合物的研究,將集中在靈芝三萜類化合物的分析檢測方法、分離純化方法、藥理藥效機制及與其他靈芝有效成分的協同作用等方面。只有這四大領域全部都取得明顯的進展,靈芝三萜類化合物的應用時代才會真正到來。
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研究發現靈芝可緩解放化療引起的腸胃道損傷
放、化療之所以會引起惡心、嘔吐、食欲不振等副作用,主要是因為藥物或放射線損傷胃腸道細胞,造成胃腸道黏膜發炎所致。情況嚴重的,會出現腹痛、腹瀉,更嚴重者,甚至會因為黏膜屏障嚴重損壞而引發全身性的病毒或細菌感染,導致多重器官衰竭,使生命受到威脅。
(1)靈芝多糖可加強胃腸道的自我修復能力。從一些腫瘤患者的實際應用經驗可知,以靈芝相關制劑協同放化療,不易出現上述的胃腸道癥狀,或癥狀比較輕微。經實驗觀察從靈芝子實體萃取出的靈芝多糖gi-ps,對小腸上皮細胞株有保護作用。實驗顯示,以不等劑量(0.1、1、10或100μg/ml)的gi-ps和小腸上皮細胞一起培養,有促進細胞增殖的作用。
(2)動物實驗證實,靈芝多糖能減輕腸道損傷、提升腸道免疫。mtx是治療癌癥常用的化療藥,“把該藥給予實驗對象的第二天,就會出現體重減輕、毛發脫落、進食和活動減少等現象;到了第三四天,這些情況將更明顯。”該實驗進行如下:連續十天給實驗對象灌胃不等劑量的靈芝多糖(50、100或200mg/kg),并于實驗第七和八天為實驗者注射mtx,結果發現,小腸黏膜受到的破壞明顯減輕,丙二醛mda(細胞膜遭受自由基攻擊后所產生的氧化產物)減少,超氧氣化酶sod(負責清除自由基的酵素)增加,lga抗體(腸道最主要的免疫指標)含量上升。整體來看,靈芝多糖對mtx化療藥的腸道損傷有減輕作用,并提升腸道免疫功能。(文/陳靜)
(摘編自2015.12.23《姑蘇晚報》http://difang.gmw.cn/newspaper/2015-12/23/content_110335023.htm)
中圖分類號:S567.3+1
文獻標識碼:A
文章編號:2095-0934(2016)02-076-06