1875例不育癥患者Y染色體微缺失的研究及評估

韓瑞鈺 宋瀟瀟 張展羽 吳江乾 劉 杰 張香改*

1．河北省計劃生育科學技術研究院遺傳研究室（河北省生殖醫學中心）（石家莊 050071）；2. 國家衛生計生委計劃生育與優生重點實驗室

·臨床經驗·

1875例不育癥患者Y染色體微缺失的研究及評估

韓瑞鈺1,2宋瀟瀟1,2張展羽1,2吳江乾1,2劉 杰1,2張香改1,2*

1．河北省計劃生育科學技術研究院遺傳研究室（河北省生殖醫學中心）（石家莊 050071）；2. 國家衛生計生委計劃生育與優生重點實驗室

全球大約有10%～15%的夫婦不育，約50%是男性因素導致的，其中遺傳因素是重要且原因明確的因素。遺傳因素主要包括染色體病和Y染色體的微缺失，其中染色體病，包括染色體平衡易位、羅伯遜易位、倒位以及性染色體異常等。Y染色體長臂遠端區域存在控制精子發生的基因為無精子癥因子（azoospermic factor，AZF），這一區域的染色體微缺失可導致精子發生障礙。男性不育門診中常常可見無精子癥和少精子癥患者，由遺傳缺陷所引起的精子發生障礙約占男性不育因素的30%［1,2］，研究表明，Yq11區存在3個精子產生位點（AZFa 、AZFb、AZFc）， 任意1個位點出現缺失，臨床上可表現為男性無精子癥或嚴重少精子癥。本文對1 875 例無精子癥和嚴重少弱精子癥患者進行染色體和AZF 缺失檢測，旨在研究和評估臨床男性不育患者與遺傳性狀的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選擇2011年3月至2015年10月到我院男科診室就診的1 875例男性不育患者，在排除了其他原因如感染等因素后對其進行精液常規分析。

二、方法

1．取精方式：包括手淫射精或睪丸穿刺。

2．分子遺傳學方法AZF檢測：用上海透景生命科技有限公司提供的Y染色體微缺失檢測試劑盒，通過多重聚合酶鏈反應（PCR）擴增，檢測Y染色體AZF區域內的6個序列標簽位點（sequence tag site），包括AZFa區：SY84，SY86；AZFb區：SY127，SY134；AZFc區：SY254，SY255。內控對照為Y染色體性別決定SRY基因，每次實驗均以已育健康男性基因組DNA作為陽性對照。多重PCR體系及擴增參照試劑盒說明書體系反應條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸30s，共擴增35個循環，最后72℃延伸10min，PCR擴增產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，120V電泳90min，凝膠成像系統觀察并照相，分析結果。

3．細胞遺傳學檢查取肝素鈉抗凝外周血進行淋巴細胞培養，染色體制備，G、C顯帶。每例計數30個中期分裂相，分析5個核型，如染色體數目異常，計數100個中期分裂相，嵌合體患者計數100個中期分裂相。

三、統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，率的比較采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、細胞遺傳學檢查結果

1 875例中檢測出188例異常核型，核型異常率為10.03%，其中47, XXY 138例，46,X,del（Yq） 12例，46,XX 13例，46,XY,inv（9） 3例，46,XY,21S+ 2例，45,X/46,XY 1例，46,XY/47,XYY 1例，45,X/46,X,r（Y）1例，46,XY,r（15） 1例，易位16例。188例異常核型中，無精子癥患者核型異常178例，發生率為19.00%（178/937）；少、弱精子癥及嚴重少精子癥患者核型異常10例，發生率為1.07%（10/938），兩者差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

二、Y染色體在無精子癥、少弱精子癥和重度少精子癥的缺失率比較

1 875名男性不育患者中，217例發生Y染色體微缺失，缺失率為11.6%。其中無精子癥937例中172例發生Y染色體微缺失，缺失率為18.4%；少、弱精子癥375中18例發生Y染色體微缺失，缺失率為4.8%，重度少精子癥563例中27例發生Y染色體微缺失，缺失率為4.8%，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

三、Y染色體在不同區域的缺失率比較

217例微缺失患者中，無精子癥172例，少弱精子癥18例，嚴重度少精子癥27例。AZF a區缺失8例，占3.7%；AZF b區缺失9例，占4.2%；AZF c區缺失122例，占56.2%；AZF b+c區缺失46例，占21.2%；AZF a+b+c區缺失32例，占14.7%。在217例Y染色體微缺失的男性患者中無精子癥患者發生的缺失率明顯高于少、弱精子癥患者和嚴重少精子癥患者。各區域缺失在無精子癥患者、少弱精子癥患者和重度少精子癥患者的發生情況見表3。

表1 染色體異常核型

表2 在無精子癥、少弱精子癥和嚴重少精子癥中Y染色體微缺失率比較

討 論

引起男性不育的原因有很多，根據《WHO 男性不育標準化檢查與診療手冊》的病因分類，男性不育可分為17 種病因，其中無精子癥和（嚴重）少精子癥患者占有很大的比例，國內外研究表明，其與Y染色體微缺失相關，男性原發無精和少精癥患者中大約有7.5%～15%存在Y染色體AZF區微缺失［3］。分子流行病學研究結果顯示，中國人原發性無精子與嚴重少精子癥患者群體AZF區STS（sequence-tagged sites）微缺失率均高于17%［4］，Chang等［5］報道，在臺灣缺失率為9%。Kim等［6］報道在韓國缺失率為7.7%。Ambulkar等［7］報道印度男性不育患者Y染色體缺失率8.83%，其中在無精子癥和重度少精子癥患者的缺失率分別10.2%和7.4%。Zaimy等［8］報道，在伊朗男性不育患者中Y染色體缺失率為8%，其中在無精子癥和重度少精子癥患者中的缺失率分別為14.6%和3.3%。本研究顯示，少弱精子癥、重度少精子癥和無精子癥患者中Y染色體的缺失率為11.6%，略高于亞洲其他國家報道的數值，這與人種差異、研究對象的選擇標準和不同的STS引物的選擇等因素有關。本研究還顯示，Y染色體微缺失在無精子癥患者中缺失率為18.4%，少弱精子癥患者中為4.8%，重度少精子癥患者中為4.8%，高于我國東北地區報道的8.3% 和 5.5%［9］，表明地域差異可能也會影響不育男性Y染色體的缺失率。

研究表明，精子的產生是一個復雜的過程，需經過兩次成熟分裂、核物質減半、細胞分化、形態轉變等，受到染色體上眾多基因的調控，相關基因的缺失可以不同程度地影響到精子的發生，并影響男性的生育能力。1976 年，Tiepolo等［10］發現6 例無精子癥患者存在顯微鏡下可見的 Y 染色體長臂缺失，于是提出Y染色體長臂上可能存在著控制精子生成的基因，并將其稱為無精子癥因子（azoospermic factor，AZF）。AZF存在于Y染色體長臂遠端（Yq11.23），其微缺失可以導致精子發生阻滯。1996年Vogt等［11］將AZF 劃分為AZFa、AZFb、AZFc 3 個相互獨立的區域，這些區域包括一些影響男胚細胞發育和維持的基因和基因家族，會影響精子的發生。睪丸活檢呈生精阻滯時發現，微缺失發生于同一亞區時，精子發生阻滯在同一時相，反之，則阻滯在不同時相。一般分為AZFa區缺失的患者精子發生阻滯在青春期前階段，其基因主導精母細胞的增殖，表現為唯支持細胞綜合征（SCOS）和小睪丸，為絕對的無精子癥，這類患者即使睪丸穿刺也無法獲取精子，不可以做 ICSI。AZFb區缺失表現為生殖細胞成熟障礙，即睪丸內只見精原細胞和初級精母細胞，而精液中無精子。行睪丸穿刺也不能獲得精子，因此對于該類患者也不可以通過 ICSI 的方式生育自己的孩子，只能通過供精的方式生育后代。AZFc區缺失情況比較復雜，表型多樣，從輕度少精子癥到無精子癥。有的患者尚存精子生成能力，對于同一患者，一些生精小管內僅見支持細胞，而另一些生精小管內可見精原細胞、精母細胞、精子細胞甚至精子，其中2/3患者表現為無精子癥，約50%的患者可以經睪丸穿刺獲得精子，余下1/3表現為少精子癥，因此AZFc 缺失者可以通過輔助生殖技術生育自己的后代，但是會將 AZFc 缺失遺傳給男性后代,但是關于Y染色體微缺失是否影響患者的ICSI治療結局，目前僅有少數的報道，且結果存在爭議。本研究中，AZFc區的缺失率為56.2%，AZFb區域缺失率為41.5%，AZFb+c區缺失率為21.2%，AZFa區與AZFa+b+c區缺失率分別為3.7%和14.7%，符合 AZF區域微缺失與無精子癥及少精子癥之間的因果關系，并與國內外報道的AZFc區是主要的缺失區域，AZFa區發生率最低的觀點一致［12］。

表3 Y染色體AZF不同區缺失在無精子癥、少弱精子癥和嚴重少精子癥中的分布

Y 染色體微缺失是男性原發不育癥的重要病因，對Y染色體缺失的檢測已逐漸發展成為診斷遺傳性男性不育的重要技術手段，不僅可以指導臨床診斷，同時對減少遺傳病的發生也具有重要意義。特別是AZF缺失的檢測對于從分子水平明確無精子癥或少精子癥患者的病因、指導睪丸活檢和卵胞漿內單精子顯微注射具有重要意義，尤其是對AZFc區的研究尤為重要，這類患者會將缺失遺傳給男性后代，女性后代不孕的風險通常不會增加，患者可以選擇輔助生殖助孕治療，進行胚胎移植前基因診斷（PGD），選擇女胚進行移植。因此，Y染色體微缺失的檢測不僅能找出非梗阻性無精子癥和中重度少精子癥男性不育的病因，也有助于患者選擇輔助生殖治療的方式，對于男性不育患者的診治具有極其重要的臨床意義，如何為這一部分患者提供遺傳咨詢和找到合適的解決生育的辦法，為他們的生殖安全提供保障，仍然是當前研究的熱點和難點，應該在這方面進行更深入的探索［13,14］。

無精子癥；少精子癥；弱精子癥；Y染色體

1 Wong WY, Thomas CM, Merkus JM,et al. Male factor subfertility: possible causes and the impact of nutritional factors.Fertil Steril2000；73（3）: 435-442

2 Hellani A, Al-Hassan S, Iqbal MA,et al.Y chromosome microdeletions in infertile men with idiopathic olig-or azoospermia.J Exp Clin Assist Reprod2006；（3）: 1

3 Kleiman SE, Yogev L, Paz G,et al. The value of the site and extent of Y chromosome microdeletions on spermatogenesis.Harefuah2002；141（2）: 178-180.

4 楊元，張思仲，彭黎明, 等. 中國人原發無精與嚴重少精癥Y染色體AZF區域微缺失的分子流行病學研究. 中華醫學遺傳學雜志 2003； 20 （5）: 385-389

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6 Kim MJ, Choi HW, Park SY,et al. Molecular and cytogenetic studies of 101 infertile menwith microdeletions of Y chromosome in 1306 infertile Korean men .J Assist Reprod Genet2012；29（6）: 539-546

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9 Fu L, Xiong DK, Ding XP,et al. Genetic screening for chromosomal abnormalities and Y chromosome microdeletions in Chinese infertile men .J Assist Repord Genet2012；29（6）: 521-527

10 Tiepolo L, Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the Y chromosome long arm.Hum Genet34, 119-124

11 Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S,et al. Human Y chromosome azoospermia factors （ AZF） mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet 1996；5（7）: 933-943

12 Sachdeva K, Saxena R, Majumdar A,et al. Use of ethnicity specific sequence tag site markers for Y chromosome microdeletion studies.Genet Test Mol Biomarkers2011；15（6）: 451-459

13 Feng C, Wang LQ, Dong MY,et al. Assisted reproductive technology may increase clinical mutation detection in male offspring.Fertil Steril2008；90（1）: 92-96

14 邵法明, 朱曉斌, 李錚, 等. 男性不育癥ICSI治療的遺傳風險分析. 中華男科學雜志 2008；14（1）: 71-74

（2016-03-20收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.010

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*通訊作者，Tel：13315995623；E-mail:779166724@qq.com