副溶血弧菌檢測方法研究進展

李紅娜,袁　飛,周偉娥,羅云敬,張　峰，*,李紹輝

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176;2.北京工業大學,北京 100124)

?

副溶血弧菌檢測方法研究進展

李紅娜1,2,袁飛1,周偉娥1,羅云敬2,張峰1，*,李紹輝1

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176;2.北京工業大學,北京 100124)

副溶血弧菌是海產品中常見致病菌,可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等疾病。由于我國是海產品消費大國,所以必須建立快速、準確、靈敏的方法監測海產品中的副溶血弧菌。目前主要應用分子生物學方法和分析化學方法,從細胞水平和分子水平來檢測副溶血弧菌,主要包括實時熒光定量PCR和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS),這兩種方法可以對副溶血弧菌進行準確定性和定量,是檢測食品中副溶血弧菌的快速、特異、靈敏的方法,可用來評估和監管海產品污染副溶血弧菌的風險,保證人們的飲食安全。

食品安全,副溶血弧菌,實時熒光定量聚合酶鏈式反應,基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

副溶血弧菌是海產品引起食物中毒的常見病原菌,適合生長的溫度范圍為15～44 ℃,-20～10 ℃容易死亡[1]。吳永寧等[2]對中國2003～2008年間的由副溶血弧菌食源性致病菌引發的食物中毒事件進行了總結,該致病菌可引起人急性腸胃炎,使人發生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀[3],副溶血弧菌引起人食物中毒常發生在4月到10月份,常見引起食物中毒食物為肉及肉制品、海產品等,通常表現為交叉污染。副溶血弧菌引起人類疾病的途徑除了飲食外,還可以通過皮膚接觸產生,如人類皮膚接觸到被副溶血弧菌感染的水后會引起傷口感染、腸胃炎或者敗血癥等[4],因此對于副溶血弧菌的監測除了市場上流通的海產品,還需對娛樂水域的水環境進行監測。

耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱直接相關溶血素(TRH)是副溶血弧菌的兩個主要的毒力因子,這兩種物質結構非常相似,都由二聚體構成,并有相似的溶血活性,維持二聚體結構是保持溶血活性必不可少的[5]。經腹腔注射表明,只有具有溶血活性的菌株具有毒性[6]。Sadok Khouadja等[7]研究表明,非致病性的副溶血弧菌可能是毒力基因庫,可水平轉移產生新的致病菌,為保證人們的飲食健康和生命安全,需要建立快速、準確、行之有效的方法對致病性副溶血弧菌及非致病性副溶血弧菌進行全面監測。

本文對近幾年副溶血弧菌的檢測方法進展進行了概括,為保障人們的飲食衛生和娛樂水域安全提供保障。

1　菌體檢測

食品中對于菌體的檢測的目的是對菌落進行定量或者定性,菌體的檢測方法主要有平板計數法、生化實驗法、菌落雜交法、質譜法及免疫層析法。其中平板計數法屬于定量方法,生化實驗法屬于定性方法,菌落雜交和免疫層析法屬于定性及半定量法,質譜法屬于定性和完全定量法。

1.1平板菌落計數法

將樣品研磨并配成溶液,稀釋一定的濃度梯度,采用傾注法或者涂布法將樣品接種于培養基上,在一定的條件下進行培養,一定稀釋倍數的樣品中的細菌可單個分散在平板上形成肉眼可見的菌群,菌群的數量代表細菌總數,這里的菌落總數是指符合該培養條件的菌的總數,不是絕對的活菌數量。細菌在存活非培養狀態時不能形成菌落，可能會造成檢測的菌落總數低于實際菌落總數[8]。

1.2生化實驗法

根據菌種的生理生化及表觀特征對菌種進行鑒定,是微生物鑒定的常用方法,目前全自動微生物鑒定儀已經成為一套成熟的微生物鑒定系統。典型的副溶血弧菌在硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂培養基上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落,具有氧化酶陽性、賴氨酸脫氫酶陽性、硫化氫陰性、有動力、發酵葡萄糖和甘露醇、不發酵蔗糖和乳糖等生化特征[9]。與MALDI-TOF MS和16S rDNA聚合酶鏈式反應相比,全自動微生物鑒定儀VITEK2只能對菌屬進行準確定性而不能準確區別菌種。VITEK微生物鑒定儀是根據微生物的生理生化特征進行鑒別微生物,而同一菌屬之間的菌種生化特征差別不大,因而在菌種鑒別上受到很大限制,數據庫的存儲的菌種數據需要進一步擴充和更新[10-12]

1.3菌落雜交法

基于菌種的特異性基因設計探針,用放射性同位素或者熒光物質標記探針,通過裂解細菌使探針與細菌特異性基因結合,通過檢測信號判斷陽性或者陰性。Elisabetta Suffredini等[13]建立了菌落雜交法對總副溶血弧菌進行計數。采用異羥基洋地黃毒甘標記4種探針,tdh1、tdh2、trh1和trh2,檢測了70株標準菌株和356株從環境、食品和臨床分離得到的菌株,特異性能達到100%,線性相關系數在0.895～0.987之間。采用菌落雜交法、國際標準法和菌落計數法檢測了104個天然樣本,菌落雜交法和國際標準法的準確度可達到86.7%,菌落雜交法可替代菌落計數法檢測海產品中的致病性副溶血弧菌。J R López等[14]建立了反向線點雜交技術檢測黃桿菌屬、弧菌屬、發光桿菌屬及假單胞菌。根據16-23S基因間隔區的特異性片段或者23S rRNA的特異性片段制備特異性的生物探針,標準菌株和臨床分離菌株通過反向線點雜交均能準確鑒別,除了哈維氏弧菌的探針與坎氏弧菌擴增產物有交叉反應外,其余非目標菌株均表現為陰性。這是第一個鑒別魚類細菌性病原體的反向線點雜交方法,對于水產養殖的流行病學研究和疾病控制具有重要意義。菌落雜交法費時費力,且可能出現非特異性結合的現象而使檢測結果出現假陽性。

1.4質譜法

是根據待測微生物的蛋白指紋譜圖與蛋白指紋譜圖庫進行特征比較,快速對微生物進行定性。René Erler等[15]建立了弧菌屬的質譜譜圖庫,檢測的準確度高,而且可開放獲取,可用于海洋環境弧菌的檢測。SM Malainine等[16]應用MALDI-TOF MS檢測貝類、海水及沉積物中副溶血弧菌,可以將特征相似的菌株進行區分,定性準確度高。

質譜法可以準確鑒定菌種之間的差異,是一種高精度定性的方法,但對于條件致病菌銅綠假單胞菌,質譜法并不能準確鑒別,所以,質譜法也存在缺陷,數據庫有待完善[17]。

1.5免疫層析法

通過菌體表面的特異性抗原制備得到單克隆抗體,然后將抗體固定于載體表面,根據抗原抗體的特異性結合產生顯色反應,檢測樣品中是否含有目標抗原。Junko Sakata等[18-19]建立了免疫層析法檢測平板上的副溶血弧菌,檢測了124株副溶血弧菌、94株其他弧菌及35株非弧菌屬菌株,均可以準確鑒定。針對副溶血弧菌的F0F1 三磷酸腺苷合成酶抗原得到的兩種單克隆抗體mAb-VP34和mAb-VP109,由于這些抗原為高保守區的序列產物,幾乎所有的副溶血弧菌都存在相同的抗原,所以這種免疫分析方法出現假陰性的概率很小。這種方法簡單、快速,克服了副溶血弧菌在鑒別培養基上出現不同顏色反應的缺點,而且常規的生化檢測需要至少3 d時間,免疫層析法只需30 min就可得到檢測結果。免疫層析法操作較為復雜,主要表現在單克隆抗體制備的環節,也可能因為形同的抗原表位而出現交叉反應,出現假陽性結果。

2　基因檢測

根據菌體的特異性基因片段對菌種進行檢測和鑒定,是一種特異性強,耗時短,靈敏度高的分子生物學方法,應用廣泛。

2.1基因探針法

基因探針是根據待測菌種的特異性基因片段制備的互補配對的寡核苷酸鏈,基因探針需用放射性元素或者熒光標記,根據檢測標記信號判斷待測樣品中是否含有目標基因。多個基因探針整合在一起,制成基因芯片可以同時檢測多種基因,是一種高通量方法。Yu-Ri Kim等[20]采用DNA陣列雜交法將弧菌屬進行了分類,DNA陣列由23個弧菌屬的分子伴侶groESL基因間隔區的非轉錄基因片段組成,DNA陣列雜交可以準確區分副溶血弧菌和創傷弧菌。

2.2聚合酶鏈式反應

根據目標菌的標志性基因設計特異性引物進行體外擴增,然后用EB染料對擴增產物進行染色,進行葡聚糖凝膠電泳,在紫外成像儀下觀察電泳條帶,判斷待測樣品是陰性還是陽性。Muhammad Tofazzal Hossain等[21]采用多重聚合酶鏈式反應檢測和鑒別副溶血弧菌,引物設計的對象為生物特異性標志物,分子伴侶groEL、耐熱直接溶血素tdh和耐熱直接相關溶血素trh,經過人工污染樣品檢測表明該方法可用于快速檢測和鑒別副溶血弧菌分離菌株。Mohammadjavad Paydar等[22]建立了傳統PCR結合基因外重復回文序列PCR技術來檢測和鑒別副溶血弧菌。多重PCR檢測編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白基因gyrB和管家基因pntA,可以有效篩選副溶血弧菌,而REP-PCR可以對不同血清型進行鑒別。

2.3實時熒光定量PCR

與普通PCR相比,省去了用EB染色的部分,操作更加安全;實時監測反應結果,避免出現假陽性現象;可以對菌種進行絕對定量。Annick Robert-Pillot等[23]建立了以水解探針為目標基因的實時熒光PCR技術來檢測和鑒定副溶血弧菌、創傷弧菌及霍亂弧菌,這種方法特異性強,可用于海鮮中弧菌類致病菌的檢測。Min-Hee Kang等[24]建立了2步快速實時熒光PCR檢測副溶血弧菌的耐熱直接溶血素基因tdh,這種方法所需樣品量少,特異性強,準確率高,是目前檢測副溶血弧菌的最快的方法。Alejandro Garrido等[25]采用多重實時熒光PCR檢測水和海產品中的副溶血弧菌。目標基因為thd、trh1和trh2,檢測限分別為6、11、8 cfu/25 g。國際標準ISO 21872-1:2007檢測總副溶血弧菌需要至少3 d時間,而多重實時熒光PCR檢測及鑒別副溶血弧菌只需24 h。這種方法是實用性強、操作簡便、特異性強、靈敏度高的高通量檢測方法。

2.4環介導等溫PCR

環介導等溫PCR是一種較為溫和核酸擴增方法,與普通PCR相比,特異型性更強,靈敏度更高,而且比熒光PCR成本低,所需設備簡單,應用范圍較廣。Tan Turk Hsern Malcolm等[26]比較了環介導等溫PCR和多重PCR檢測海產品中的副溶血弧菌,結果表明,雖然這兩種方法的檢測結果區別不太,但是在樣品中目標菌株含量較低時環介導等溫擴增法比多重PCR更具有優勢。

3　代謝物檢測

檢測菌種的特異性標志物,是鑒別菌種的一種重要手段,檢測的目標主要為毒素及酶類。副溶血弧菌的主要代謝毒素為耐熱直接溶血素、耐熱直接相關性溶血素等。

3.1酶聯免疫吸附法

酶標記抗體與固定在載體表面的抗原或者抗抗體特異性結合,用適當的溶劑沖洗載體表面,去除沒有結合的酶標抗體,然后加上酶底物,底物與酶發生顯色反應,根據顏色的深淺判斷待測樣品中是否含有待測物質。Ballamoole Krishna Kumar等[27]建立了酶聯免疫吸附實驗檢測副溶血弧菌的耐熱直接溶血素TDH,由于耐熱直接溶血素和耐熱相關直接溶血素具有相似的抗原表位,所以,ELISA的方法并不能加以區別,這種方法可用于常規的實驗室檢測,就有高通量、簡單、快速的優點,但是需要專業人員和專業技術。

3.2基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法

是一種新興的生物質譜,具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點,為生命科學領域提供了一種強有力的分析測試手段。副溶血弧菌產生的耐熱直接溶血素(TDH)是一種成孔毒素,可以溶解真核細胞。Silke Bechlars等[28]進行體外合成標簽TDH,并用聚丙烯酰氨凝膠電泳、基質輔助激光解吸串聯飛行時間質譜及免疫學方法進行檢驗,發現TDH的前體及衍生物均沒有溶血活性。

3.3高效液相色譜法

高效液相色譜應用領域較廣,是最有效的分離分析手段,絕大多數化合物都可用高效液相色譜進行檢測,在高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物分析方面具有明顯優勢。Baskar Balakrishnan等[29]采用高效液相色譜方法檢測了副溶血弧菌產的弧菌素,高效液相方法在分離混合物方面具有很大的優勢,可以幫助分離菌株培養混合物,發現菌株的特異性代謝產物,是鑒別不同菌株的有效方法。

4　展望

副溶血弧菌感染海產品引起食物中毒的危害巨大,目前海產品中檢測副溶血弧菌的有效方法多為實時熒光定量PCR,雖然檢測的靈敏度、特異性、準確度都很高,但是所需儀器設備昂貴,檢測成本較高,環介導等溫PCR技術在靈敏度、特異性方面都優于普通PCR,與實時熒光PCR相比,成本更低,是一種可替代方法。

目前檢測副溶血弧菌的方法主要是針對活菌進行檢測,而對于副溶血弧菌的代謝毒素檢測不夠重視,副溶血弧菌的代謝產物耐熱直接溶血素是一種耐熱、耐胰蛋白酶的多肽,是副溶血弧菌的主要毒力因子,其檢測方法局限在免疫學方法,免疫學方法不僅耗時長,檢測靈敏度低,而且特異性較差,需要建立新的快速、準確、靈敏、可靠的檢測方法檢測副溶血弧菌的毒力因子。此外,在開發有效抑制副溶血弧菌生長繁殖的抑制劑時,對于菌的活性狀態的檢測也是非常有必要的,這方面的檢測技術也需要盡快建立。

[1]Arisara Boonyawantang,Warapa Mahakarnchanakul,Chitsiri Rachtanapun,et al. Behavior of pathogenicVibrioparahaemolyticusin prawn in response to temperature in laboratory and factory[J]. Food Control,2012(26):479-485.

[2]Yongning Wu,Jian Wen,Yi Ma,et al. Epidemiology of foodborne disease outbreaks caused byVibrioparahaemolyticus,China,2003-2008[J]. Food Control,2014(46):197-202.

[3]林祥田. 94起副溶血弧菌食物中毒流行病學特征分析[J].營養與食品衛生,2006,18(3):141-143.

[4]Kristi S Shaw,Amy R Sapkota ,John M Jacobs,et al. Recreational swimmers’ exposure toVibriovulnificusandVibrioparahaemolyticusin the Chesapeake Bay Maryland USA[J]. Environment International,2015(74):99-105.

[5]Ohnishi Kiyouhisa,Nakahira Kumiko,Unzai Satoru,et al. Relationship between heat-induced fibrillogenicity and hemolytic activity of thermostable direct hemolysin and a related hemolysin ofVibrioparahaemolyticus[J]. FEMS Microbiology Letters,2011,318(1):10-17.

[6]Sadok Khouadja,Faouzi Lamari,Amina Bakhrouf. Characterization ofVibrioparahaemolyticusisolated from farmed sea bass(Dicentrarchus labrax)during disease outbreaks[J]. International Aquatic Research,2013,5:13.

[7]Sadok Khouadja,Elisabetta Suffredini,Besma Baccouche,et al. Occurrence of virulence genes amongVibriocholeraeandVibrioparahaemolyticusstrains from treated wastewaters[J]. Environ Monit Assess,2014(186):6935-6945.

[8]Kimberly J Griffitt,Nicholas F Noriea III,Crystal N Johnson,et al. Enumeration ofVibrioparahaemolyticusin the viable but nonculturable state using direct plate counts and recognition of individual gene fluorescence in situ hybridization[J]. Journal of Microbiological Methods,2011(85):114-118.

[9]中華人民共和國 國家衛生和計劃生育委員會. GB 4789.7-2013 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗[S]. 北京:中國標準出版社,2014.

[10]Dulce Sachiko Yamamoto de Figueiredo,Jo?o Nobrega de Almeida Jr,Adriana Lopes Motta,et al. Evaluation of VITEK 2 for discriminating Trichosporon species:misidentification of Trichosporon non-T. asahii[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2014(80):59-61.

[11]Jo?o Nobrega de Almeida Júnior,Letícia Bonato de Souza,Adriana Lopes Motta,et al. Evaluation of the MALDI-TOF VITEKMSTMsystem for the identification of Candida parapsilosis,C.orthopsilosisandC.metapsilosisfrom bloodstream infections[J]. Journal of Microbiological Methods,2014(105):105-108.

[12]Percy Schr?ttner,Wolfram W Rudolph,Bodo R Eing,et al. Comparison of VITEK2,MALDI-TOF MS,and 16S rDNA sequencing for identification ofMyroidesodoratusandMyroidesodoratimimus[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2014(79):155-159.

[13]Elisabetta Suffredini,Loredana Cozzi,Gianni Ciccaglioni,et al. Development of a colony hybridization method for the enumeration of total and potentially enteropathogenicVibrioparahaemolyticusin shellfish[J]. International Journal of Food Microbiology,2014(186):22-31.

[14]J R López,J I Navas,N Thanantong,et al. Simultaneous identification of five marine fish pathogens belonging to the generaTenacibaculum,Vibrio,PhotobacteriumandPseudomonasby reverse line blot hybridization[J]. Aquaculture,2012,324-325:33-38.

[15]René Erler,Antje Wichels,Ernst-August Heinemeyer,et al. VibrioBase:A MALDI-TOF MS database for fast identification ofVibriospp. that are potentially pathogenic in humans[J]. Systematic and Applied Microbiology,2015(38):16-25.

[16]S M Malainine,W Moussaoui,G Prevost,et al. Rapid identification ofVibrioparahaemolyticusisolated from shellfish,sea water and sediments of the Khnifiss lagoon,Morocco,by MALDI-TOF mass spectrometry[J]. Letters in Applied Microbiology,2013(56):379-386.

[17]Kaveh Emami,Vahid Askari,Matthias Ullrich,et al. Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass Spectrometry[J]. PLoS One,2012,7(6):e38515.

[18]Junko Sakata,Kentaro Kawatsu,Tadashi Iwasaki,et al. Development of a rapid and simple immunochromatographic assay to identifyVibrioparahaemolyticus[J]. Journal of Microbiological Methods,2015(116):23-29.

[19]Kentaro Kawatsu,Junko Sakata,Taro Yonekita,et al. Evaluation of an immunochromatographic assay for direct identification of thermostable direct hemolysin-producingVibrioparahaemolyticuscolonies on selective agar plates[J]. Journal of Microbiological Methods,2015(119):4-6.

[20]Yu-Ri Kim,Eun-Young Kim,Dong-Gyun Kim,et al. DNA array with the groESL intergenic sequence to detectVibrioparahaemolyticusandVibriovulnificus[J]. Analytical Biochemistry,2012(424):32-34.

[21]Muhammad Tofazzal Hossain,Young-Ok Kim. In-Soo Kong. Multiplex PCR for the detection and differentiation ofVibrioparahaemolyticusstrains using the groEL,tdh and trh genes[J]. Molecular and Cellular Probes,2013(27):171-175.

[22]Mohammadjavad Paydar,Cindy Shuan Ju Teh,Kwai Lin Thong. Prevalence and characterisation of potentially virulentVibrioparahaemolyticusin seafood in Malaysia using conventional methods,PCR and REP-PCR[J]. Food Control,2013(32):13-18.

[23]Annick Robert-Pillot,Stéphanie Copin,Charlotte Himber,et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR[J]. International Journal of Food Microbiology,2014(189):75-81.

[24]Min-Hee Kang,Il-Wook Kim,Dong-Woo Lee,et al. Development of a rapid detection method to detect tdh gene inVibrioparahaemolyticususing 2-step ultrarapid real-time polymerase chain reaction[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2011(69):21-19.

[25]Alejandro Garrido,María-José Chapela,Martia Ferreira,et al. Development of a multiplex real-time PCR method for pathogenicVibrioparahaemolyticusdetection(tdht and trht)[J]. Food Control,2012(24):128-135.

[26]Tan Turk Hsern Malcolm,Yoke Kqueen Cheah,Che Wan Jasimah Wan Mohamed Radzi,et al. Detection and quantification of pathogenicVibrioparahaemolyticusin shellfish by using multiplex PCR and loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Food Control,2015(47):664-671.

[27]Ballamoole Krishna Kumar,Pendru Raghunath,Devananda Devegowda,et al. Development of monoclonal antibody based sandwich ELISA for the rapid detection of pathogenicVibrioparahaemolyticusin seafood[J]. International Journal of Food Microbiology,2011(145):244-249.

[28]Silke Bechlars,Doreen A Wüstenhagen,Katja Dr?gert,et al. Cell-free synthesis of functional thermostable direct hemolysins ofVibrioparahaemolyticus[J]. Toxicon,2013(76):132-142.

[29]Baskar Balakrishnan,Jayappriyan Kothilmozhian Ranishree,Sathish Thadikamala,et al. Purification,characterization and production optimization of a vibriocin produced by mangrove associatedVibrioparahaemolyticus[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine,2014,4(4):253-261.

Research progress of detecting methods forVibrioparahaemolyticus

LI Hong-na1,2,YUAN Fei1,ZHOU Wei-e1,LUO Yun-jing2,ZHANG Feng1,*,LI Shao-hui1

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;2. Beijing University of Technology,Beijing 100124,China)

Vibrioparahaemolyticuswhich can cause illness like nausea,vomit,stomachache and diarrhea etc. is ubiquitous pathgenic bacteria in seafood. China is a consumption country of seafood,it is necessary to establish rapid,accurate and sensitive method monitoringVibrioparahaemolyticusin seafood. At present,molecular biology methods and analytical chemistry methods based on cell level and molecular level include real-time PCR and MALDI-TOF MS uauslly be used to determine and quantifyvibrioparahaemolyticusin seafood,which are fast,specific and sensitive. It can be used to evaluate and supervise the risk ofVibrioparahaemolyticusin seafood and ensure the safety of people’s diet.

food security;Vibrioparahaemolyticus;real-time PCR;MALDI-TOF MS

2015-11-09

李紅娜(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：化學生物學與分子醫學，E-mail：lihongna1@163.com。

張峰(1974-)，男，博士，研究員，研究方向：分析化學，E-mail：fengzhang@126.com。

公益性行業科研專項經費項目(201510038)；國家質檢總局科技計劃項目(2014IK084)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)12-0371-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.062