黑曲霉固態發酵香蕉皮產果膠酶的培養基條件研究

韋璐　唐婷　寧恩創

摘要：為研究開辟香蕉資源綜合利用新途徑，以香蕉皮及麩皮為主要原料，黑曲霉CICC40493為發酵菌種，采用單因素和正交試驗，研究確定固態發酵果膠酶的基礎培養基配比。結果顯示，果膠酶最適基礎培養基為：香蕉皮渣3g、麩皮7g、硫酸銨0.45g、水15mL；影響酶活力的主次順序為：麩皮和香蕉皮渣配比>硫酸銨添加量>去離子水添加量，最佳配比的培養基在自然pH值，裝瓶量10g干料/250mL三角瓶，接種量1.0mL的條件下，28℃恒溫培養72h，獲得的果膠酶總活力為10853.54U。試驗結果表明利用香蕉皮接種黑曲霉CICC40493固態發酵生產果膠酶是可行的，為開辟香蕉資源綜合利用新途徑的研究提供數據支持。

關鍵詞：香蕉皮；固態發酵；黑曲霉；果膠酶

中圖分類號：TS201.4 文獻標識碼：A 文章編號：1003-4374（2015）06-0025-04

Abstract： To prepare banana peel and wheat bran as main raw materials， Aspergillus Niger CICC40493 as fermentation， and then to adopt single factor and orthogonal experiments determine mixture ratio of solid-state fermentation pectinase basic culture medium. The result showed that the optimum culture medium for pectinase was as follow： banana peel 3g， bran 7g， ammonium sulfate 0.45g， deionized water 15mL；The primary and secondary sequence of the enzyme activity was the ratio of banana peel and wheat bran>addition of ammonium sulfate>addition of deionized water， the optimal proportion of medium was fermented in the following conditions： natural pH， bottling capacity 10g drier/250mL triangle bottle， inoculation 1.0mL， 28℃ as fermentation temperature，and 72 hours as fermentation time， then， experimenter would get the total activity pectinase was 10853.54U. The result showed that producing pectinase by the banana peel inoculated with solid state fermentation of Aspergillus niger CICC40493 was feasible.

Key words： Banana peel； solid state fermentation； aspergillus niger； pectinase

香蕉是一種營養豐富，價格低廉的典型熱帶經濟作物，廣泛種植于我國的廣西、廣東等華南地區[1，2]。香蕉皮則是香蕉在深加工過程中產生的主要廢棄物，約占香蕉總質量的30%-40%[3]，因此開展以香蕉皮作為原料進行深加工的研究對香蕉的綜合利用、提高產業附加值及保護環境都具有重要的意義。在前期對香蕉皮中主要營養成分的測定中發現，香蕉皮中總糖、蛋白質、果膠含量尤其豐富，可提供給微生物發酵所需的碳源、氮源，其中果膠質還可以作為發酵生產果膠酶的誘導物。

果膠酶是世界四大酶制劑之一，能降解果膠質，廣泛應用于食品、醫藥、紡織和環保等領域等行業中，在全世界食品酶的銷售額中占25%[4-7]。微生物是生產果膠酶的優良生物資源，在果膠酶的工業化生產中以霉菌最為常見[8，9]。通過查閱文獻發現，目前在果膠酶的發酵制備中，已經有利用蘋果渣、菠蘿渣、橘皮渣等富含果膠的農產品加工副產物做發酵原料生產果膠酶的報道[10-12]，但利用黑曲霉作為發酵菌種，香蕉皮和麩皮作為發酵主料的研究還不多見。

文章采用單因素及正交試驗開展了以香蕉皮和麩皮作為主要原料，黑曲霉CICC40493為發酵菌種，采用單因素試驗和正交試驗進行固態發酵，確定基礎培養基的配比，為開辟香蕉資源綜合利用的新途徑提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

香蕉：購于廣西南寧西鄉塘市場，烘干后打碎，過400目篩，備用。

麩皮：購于廣西南寧西鄉塘市場，過400目篩，備用。

1.2 試劑

考馬斯亮藍G250、磷酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銨、90%乙醇、乙酸、乙酸鈉、酒石酸鉀鈉、3-5二硝基水楊酸鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、冰醋酸，均為國產分析純；果膠標準、半乳糖醛酸標準、牛血清蛋白標準，sigma公司產；黑曲霉CICC40493中國工業微生物菌種保藏中心。

1.3 儀器

VIS-7220N紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；T500型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；1010-3型電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；KQ-600DV型數控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；3H16RI冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；PL203型分析天平，梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；KEDA-A6智能版通風柜，深圳申立；yxq-ls-100sll高壓滅菌鍋，上海博迅實業有限公司。

1.4 培養基及培養條件

菌種保存與三角瓶擴大培養采用PDA培養基。培養條件：28℃恒溫培養120h，斜面菌種及三角瓶擴大培養菌種置于5℃冰箱保存。

固態發酵基礎培養基：一定比例的干香蕉皮與麩皮混合（總量為10g），加入一定量的硫酸銨和去離子水攪拌均勻，裝入250mL三角瓶瓶中，121℃濕熱滅菌40min。培養條件：自然pH值下，裝瓶量10g干料/250mL 三角瓶，接入1.0mL的黑曲霉CICC40493孢子懸浮液（菌懸液A430nm=0.05，孢子數為5×105個/mL菌液），28℃恒溫培養72h。培養過程中于12h、24h、36h各搖瓶一次。

1.5 實驗方法

1.5.1 黑曲霉CICC40493孢子懸浮液的制備 取已培養好的三角瓶菌種一瓶，加入50mL無菌的質量分數為0.85%的生理鹽水，輕輕將培養基表面的孢子刮下，將孢子懸浮液置于已滅菌的三角瓶中，瓶中預先放入數粒無菌玻璃球，充分振搖后用無菌脫脂棉過濾制備成孢子懸浮液。

1.5.2 粗酶液的制備 發酵完畢后，往三角瓶中加入80mL純水，開啟超聲波提取器進行提取（提取溫度32℃，超聲波功率70%，提取1h），提取完畢后4000r/min冷凍離心10min，取上清液即為果膠粗酶提取液，測定提取液中的蛋白質含量及果膠酶活力。

1.5.3 酶活力的測定 DNS顯色法[13]。以半乳糖醛酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，得到線性回歸方程y=0.5099x-0.0503，R2=0.9932。果膠酶活單位定義為：1g固體酶粉（1mL液體酶）在40℃±0.5℃ pH 4.8條件下，每分鐘水解底物產生1μg半乳糖醛酸所需酶液的量定義為一個果膠酶活性單位，以U表示。

1.5.5 單因素試驗

（1）麩皮和香蕉皮的配比對果膠酶活力的影響。麩皮、香蕉皮分別以質量比9：1，8：2，7：3，6：4，5：5比例混合（麩皮，香蕉皮總量為10g），固定硫酸銨添加量0.45g，純水12mL，培養基配比好后，按照1.4的方法進行培養，培養結束后按1.5.2的步驟制備粗酶液，測定粗酶液中的蛋白質含量及果膠酶活。

（2）硫酸銨添加量對果膠酶活力的影響。固定麩皮、香蕉皮的質量比為7：3（麩皮，香蕉皮總量為10g），純水12mL，分別添加0.25、0.35、0.45、0.55、0.65g的硫酸銨，培養基配比好后，按照1.4的方法進行培養，培養結束后按1.5.2的步驟制備粗酶液，測定粗酶液中的蛋白質含量及果膠酶活。

（3）蒸餾水添加量對果膠酶活力的影響。固定麩皮、香蕉皮的質量比為7：3（麩皮，香蕉皮總量為10g），硫酸銨0.45g，分別添加8、10、12、14、16mL的去離子水，培養基配比好后，按照1.4的方法進行培養，培養結束后按1.5.2的步驟制備粗酶液，測定粗酶液中的蛋白質含量及果膠酶活。

1.5.6 正交試驗 在單因素試驗結果上，設計了3因素3水平的正交試驗，因素水平設計見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 麩皮和香蕉皮的配比對果膠酶活力的影響 麩皮和香蕉皮的配比對果膠酶活力及蛋白質的影響見圖1，呈先上升后下降的趨勢，果膠酶的活力和蛋白質的含量變化趨勢基本一致，從菌絲的生產情況來看，當兩者的比例低于5：5時候，菌絲基本不生長，麩皮越多發酵過程中菌絲生長得越多，但酶活力不一定越高。試驗結果表明：適當的添加香蕉皮有利于菌絲在生長過程中果膠酶的合成，這是由于一方面香蕉皮中含有果膠物質，可以作為微生物發酵產果膠酶的誘導物，但是香蕉皮中還含有較多的單寧，對霉菌的生產也會有一定的抑制作用，因此適當的麩皮與香蕉皮的配比對果膠酶產出的影響較大，從圖中可以看出，當麩皮和香蕉皮的比例為7：3時，產出的果膠酶活力最高，總酶活達到6122.77U。

2.1.2 硫酸銨添加量對果膠酶活力的影響 硫酸銨是微生物培養基中常用的無機氮源，在發酵初期首先被消耗掉，消耗的過程會提高培養基的pH值，試驗中干香蕉皮中總酸含量達到3.2%，會降低培養基的pH值，而硫酸銨的加入會起到調劑pH值的作用。黑曲霉的最適合生長pH在6.0-6.5左右。從實驗結果（見圖2）可以看出，當固定麩皮、香蕉皮的質量比為7：3（兩者總量為10g），去離子水12mL的時候，添加0.35g的硫酸銨產出果膠酶的活力最大，總酶活為10812.37U。

2.1.3 水添加量對果膠酶活力的影響 水分是培養基中營養物質和微生物代謝產物的優良媒介，試驗所用的菌種為霉菌屬，喜歡生長在溫暖潮濕的環境中，因此本試驗把水的添加量也作為影響果膠酶產出的主要因素進行研究，試驗結果見圖3，隨著培養基中水分的升高，果膠酶的活力及蛋白質的含量也呈升高的趨勢，這說明充足的水分有利于黑曲霉在發酵過程中合成各種酶，從圖可以看出，當固定麩皮、香蕉皮的質量比為7：3（兩者總量為10g），硫酸銨添加0.35g時，添加14mL的水，產出果膠酶的活力最高為6912.54U。

2.2 正交試驗結果

正交試驗進一步優化培養基基本組成，在單因素試驗基礎上進行了3因素3水平的正交試驗，試驗結果見表2，由均值可知，理論上最佳的培養基組合為A3B2C3，即麩皮和香蕉皮配比為7：3（兩者總量為10g），硫酸銨添加量為0.45g，蒸餾水添加量為15mL，在該條件下做驗證試驗，試驗平行3次，獲得果膠酶活力的平均值為10853.54U。由極差值可知，影響果膠酶酶活力因素的主次順序為：麩皮和香蕉皮配比>硫酸銨添加量>水添加量。方差分析可知（見表3）在實驗設計的范圍內，麩皮和香蕉皮的配比對果膠酶活力具有顯著的影響，硫酸銨和水的添加量則影響不顯著。

3 討論

香蕉皮是香蕉深加工過程中的主要廢棄物，研究發現香蕉皮中不僅含有適合微生物生長的營養成分，如糖分、蛋白質、維生素、礦物質等，還含有產果膠酶的誘導物果膠質，但同時也含有抑制微生物生長的單寧等成分，因此在研究其發酵產果膠酶的培養基基本組成時，香蕉皮與麩皮的配比對產果膠酶的影響顯得尤為重要，實驗結果也證明了兩者的比例對果膠酶活力的影響最為顯著，同時也證明了用香蕉皮作為微生物固態發酵產果膠酶在技術上具有可行性。香蕉作為在市場上普遍銷售的一種水果，具有量大且價格低廉等特點，因此，利用香蕉皮發酵生產果膠酶一方面可大幅度降低生產成本，一方面還可以解決香蕉皮的綜合利用問題。

4 結論

用香蕉皮及麩皮為主要原料，黑曲霉CICC40493為發酵菌種，采用單因素和正交試驗確定生產果膠酶的基礎培養基的配比為：香蕉皮3g、麩皮7g、（NH4）2SO4 0.45g、水15mL；影響香蕉皮產果膠酶酶活力因素的主次順序為：麩皮和香蕉皮配比>硫酸銨添加量>去離子水添加量；最佳配比的培養基在自然pH值下，培養基裝瓶量10g干料/250mL三角瓶，接種量1.0mL（菌懸液A430nm=0.05，孢子數為5×105個/mL菌液），28℃恒溫培養72h，所產果膠酶酶總活力可達10853.54U。試驗結果表明利用香蕉皮接種黑曲霉發酵生產果膠酶是可行的。

參考文獻：

[1] 趙肅清，孫遠明，蔡燕飛，等. 香蕉皮黑色素的鑒定及其抗氧化作用研究[J]. 中草藥，2002，33（6）：496-498.

[2] 徐云升，宋維春.香蕉皮制備多功能膳食纖維添加劑的研究[J].食品工業科技， 2005， （11）： 14.

[3] 閆文杰，李鴻，艾秋實，等.香蕉和香蕉皮的加工利用[J].中國食物與營養，2008，（12）：30-32.

[4] Kapoor M，Beg QK，Bhushan，et a1.Production and partial purificationand characterization of a thermo-alkali stable polygalachuronasefrom Bacillus sp，MG-CP-2 [J].Process Blochemistry， 2000，（36）：467-473.

[5] 李祖明，張洪勛，白志輝，等.微生物果膠酶研究進展[J].生物技術通報，2010，（3）： 42-49.

[6] 吳振強，梁世忠.糖蜜酒精蒸餾廢液色素研究[J]. 環境污染與防治，2002，24（1）：14-18.

[7] Kashyap DR，Vohra PK，Chopra S，et al. Applicaions of pectinasesin the commercial sector：areview[J].Bioresource Technology，2001，（77）：215-227.

[8] Gummadi SN，Panda T. Purification and biochemical properties ofmicrobial pectinases： a review[J].Process Blochemistry，2003，（38）：987-996.

[9] JayaniR. S， Saxena S， Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes：A review[J]. Process Biochem istry， 2005，（40）： 2931-2944.

[10] 鄧毛程，王瑤，李勝.黑曲霉利用菠蘿皮培養基發酵產果膠酶的研究[J].中國釀造，2009，（7）：106-109.

[11] 姜心，陳偉，周波.蘋果渣固態發酵產復合酶培養基優化的研究[J].山東農業科學，2010，（1）： 80-85.

[12] 林華娟，秦小明，張初署，等.菠蘿渣生產果膠酶的研究[J].食品科技，2009 ，（5）：70-72.

[13] 王天龍，仇宏偉，陳海華，等.3，5-二硝基水楊酸法測定果膠酶活力的條件研究[J].食品與機械，2008，24（3）：96-104.

[14] 黃婉玉， 曹煒， 李菁，等.考馬斯亮藍法測定果汁中蛋白質的含量[J].食品與發酵工業，2009，35（5）：160-162.