慢性應激對小鼠空間學習記憶的影響及腦內Wnt3a的表達

李洋　肖婧姍　張忠秋　李亞

【摘 要】目的：研究慢性應激對小鼠空間學習記憶的影響及機制。方法：慢性應激模型的建立采用的是持續21天的7種不同應激方式，通過Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學習記憶能力，免疫組織化學方法檢驗小鼠腦內各腦區wnt3a的表達。結果：慢性應激組小鼠與對照組小鼠相比，在定位航行試驗中，小鼠尋找平臺的逃避潛伏期明顯提高（P<0.05），空間搜索實驗中，應激組小鼠在目標象限的游泳時間明顯減少（P<0.05）。在小鼠腦內PFC區wnt3a表達顯著減少（P<0.01）。結論：慢性應激對小鼠空間學習記憶的能力具有損傷作用，這與wnt3a在腦內的表達關系密切。

【關鍵詞】慢性應激；學習記憶；Wnt3a；海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective To study the effects of chronic stress on the spatial learning-memory function of mice and its mechanism. Method The chronic stress model of mice was induced by stimulation of multiple stressors for 21 days. The ability of spatial learning-memory of mice were determined by Morris Water maze task， and the expression of Wnt3a in the hippocampus and prefrontal cortex were detected by immunohistochemical method .Result After chronic stress， the stress groups escape latency in the place navigation test were significantly higher than control group mice（P<0.05）. In the spatial search test， after chronic stress ，respectively compared with control group mice， in first quadrant （i.e. platform quadrant） the swimming time of stress group mice were obviously shortened（P<0.05）. TheWnt3a expression in PFC were significantly shortened in stress group mice（P<0.01）. Conclusion The ability of chronic stress on spatial learning and memory in mice has the function of damage， which is closely related to the expression of Wnt3a in brain.

【Key words】Chronic stress； Learning and memory； Wnt3a； Hippocampus； Prefrontal cortex

研究表明，長期強烈身心應激嚴重影響著人類的身心健康，使機體出現抑郁癥、學習記憶障礙、應激性精神紊亂、免疫力低下等多系統疾病[1]。慢性應激可以誘導抑郁癥已成為公認事實，有抑郁癥史的自殺病人的行為表現與慢性應激引發癥狀非常一致[2， 3]。慢性應激可造成機體大腦器質性損壞，尤其是海馬結構和功能的損害，最終引發抑郁癥[4]。相關研究發現，在正常成年哺乳動物中樞神經系統（central nervous system，CNS）中Wnt3a可以促進神經發生來進行自我更新與組織修復，在蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷研究中，Wnt3a可能通過經典Wnt 信號通路促進神經發生，對中樞神經系統的修復與保護發揮積極作用[5]。本實驗研究慢性應激模型小鼠空間學習記憶功能的變化以及海馬和前額葉皮層Wnt3a 表達的變化，探討慢性應激對小鼠空間學習記憶的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與建立慢性應激動物模型

2月齡的昆明品系小白鼠，體重20±2g，雌雄各半，購于山東濟寧魯抗醫藥公司動物實驗中心。小鼠適應一周。飲水，進食自由，隨機分為對照組和應激組，每組12 只。

應激組采用多因素的慢性不可預知應激動物模型進行研究。其中應激組為：小鼠在21天內接受7應激源刺激包括高臺（1 h，高臺呈圓柱體高1.6m，直徑0.05m）、通宵照明（10h）、冰水游泳（8℃冷水中游泳3min）、禁食（36h）、禁水（24h）、斜籠擁擠（36h）、足底電擊（電壓36V，1min/次，每次持續10s，共30次）。每天給予一種刺激（采用無規則的交替刺激）使小鼠無法預知應激源的變化以及刺激的發生；對照組小鼠在相同飼養環境中正常飼養21天，不接受任何實驗應激源。對照組不接受應激，正常狀態飼養。

1.2 Morris水迷宮檢測學習記憶能力

采用Morris 水迷宮，檢測兩組小鼠的學習記憶能力。Morris 水迷宮由圓形水池和池內一可移動平臺組成，直徑80cm，高50cm，水溫26±1℃。測試程序包括定位航行和空間搜索兩個實驗步驟。水迷宮被均分為4個象限，平臺置放于第一象限（目標象限），并在第三象限池壁做紅色標記，使之于平臺連線為水池直徑。定位航行實驗共2d，每只小鼠每天兩個訓練周期，每個周期內接受4 次找平臺訓練，小鼠分別對應一個象限入水，每次訓練120s。記錄小鼠入水至找到水下平臺的逃避潛伏期（escape latency）。第3d 進行空間搜索試驗，撤除平臺，小鼠由第三象限入水點入水， 記錄小鼠120s 內在4 個象限的游泳時間，以檢測小鼠對平臺（目標象限）的記憶能力。

1.3 小鼠海馬和前腦皮層Wnt3a的表達

在完成水迷宮空間試驗后，戊巴比妥鈉注射麻醉小鼠，取出心臟，快速灌注37℃生理鹽水50ml 及4℃的4%多聚甲醛溶液50ml，開顱取腦，后固定2h，酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后進行冠狀切片（厚約5μm）。免疫組化實驗一抗及試劑盒均購自武漢博士德生物公司，按照試劑盒的要求操作。陰性對照選擇PBS（磷酸緩沖液）代替一抗。選擇每只小鼠相應海馬部位和前腦皮層（PFC）切片3 張，每張隨機選取兩個不相重疊的視野，用Motic Images Advanced 3.2 圖像處理系統對海馬和前腦皮層的Wnt3a陽性細胞平均目標灰度值進行分析。

1.4 統計學處理

所有數據以平均數±標準差（M±s）來表示，逃避潛伏期采用重復測量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳時間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較以Newman-Keuls 法分析。其他數據組間比較用非配對t 檢驗分析。P<0.05 時說明有統計學差異。

2 結果

2.1 各組小鼠空間學習記憶功能的變化

定位航行試驗數據進行統計學分析結果顯示（表1）：慢性應激后，對照組和應激組兩組小鼠隨訓練其逃避潛伏期均顯著降低（F= 4.958，P<0.01；F= 7.225，P<0.01）。在4個訓練周期中，應激組小鼠的逃避潛伏期均長于對照組小鼠（P<0.05）。結果表明，慢性應激對小鼠的空間學習記憶功能造成損傷。

空間搜索實驗中各組小鼠實驗統計結果如下（表2）：慢性應激后，各組小鼠的游泳停留時間均在第一象限（即平臺象限）最長。對照組小鼠在慢性應激后，與其余三個象限比較，在第一象限的游泳時間顯著延長（F= 5.452，P<0.01）；與其它三個象限比較，而應激組小鼠在慢性應激后在第一象限的停留時間差異不顯著（F= 0.6124，P>0.05）。在第一象限的組間比較：慢性應激后，相較于對照組，應激組的游泳時間明顯延長（P<0.05）。

2.2 各組小鼠海馬和前腦皮層wnt3a表達

小鼠免疫組化結果（表3）：在對照組小鼠海馬CA1、CA3椎體細胞層和DG區顆粒細胞神經元中均未明顯表達Wnt3a且差異不明顯；但在前腦皮層中，與對照組比較，應激組小鼠在應激即刻Wnt3a陽性細胞數顯著減少（P<0.01）。

3 討論

慢性應激可導致機體大腦器質性損壞，尤其是海馬結構和功能的損害，最終引發抑郁癥，而且有神經精神系統損傷[6]。慢性應激導致腦損傷的同時有一個與之相反的活動保護著中樞神經系統，也就是神經發生。有研究報道，在正常成年哺乳動物CNS中Wnt3a 可以促進神經發生來進行自我更新與組織修復；在早期腦損傷研究中，Wnt3a 可能通過經典Wnt 信號通路促進神經發生[5]，對中樞神經系統的修復與保護發揮積極作用。Wnt3a 之所以能夠增強神經發生作用，其機制可能與Wnt 通路有關[7]。已有研究顯示，Wnt 信號通路參與了成年期NSCs 的增殖、分化以及細胞命運的調控[8]，甚至對神經系統的發育包括突觸形成、建立皮質模式等也是至關重要的[9]。本研究中，慢性應激后，各組小鼠的游泳停留時間均在第一象限（即平臺象限）最長，提示小鼠均獲得記憶。在第一象限的組間比較：慢性應激后相較于對照組，應激組的游泳時間明顯延長；提示慢性應激使學習記憶遭受一定程度的損壞。小鼠在慢性應激后各腦區wnt3a表達結果表明，小鼠的海馬各區均未有明顯的wnt3a表達，與部分文獻報道類似，推測這可能與檢測時間有一定的關系。在對照組小鼠的PFC，wnt3a廣泛表達，而應激組小鼠PFC區的wnt3a陽性細胞數量顯著減少，陽性表達較弱，細胞著色淺。本實驗研究說明，慢性應激對小鼠空間學習記憶的能力具有損傷作用，并且對應激后的恢復產生影響，這與wnt3a在腦內的表達關系密切；wnt3a對慢性應激導致的學習記憶能力的損傷有一定的保護作用。

【參考文獻】

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[責任編輯：張濤]