基于光譜法的清腦復(fù)神液指紋圖譜研究

劉　濤，伍利華，黃　英，李鵬程，張文文，徐玉玲

（1.成都大學(xué)，四川成都610106；2.四川新中方醫(yī)藥科技股份有限公司，四川廣元628000）

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基于光譜法的清腦復(fù)神液指紋圖譜研究

劉濤1，伍利華1，黃英2，李鵬程1，張文文1，徐玉玲1

（1.成都大學(xué)，四川成都610106；2.四川新中方醫(yī)藥科技股份有限公司，四川廣元628000）

摘要：為建立清腦復(fù)神液的紫外及紅外指紋圖譜評(píng)價(jià)方法，采用紫外可見分光光度計(jì)和紅外光譜儀分別測(cè)定20批清腦復(fù)神液，建立清腦復(fù)神液的對(duì)照紫外及紅外指紋圖譜，并采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算清腦復(fù)神液樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。在紫外指紋圖譜中，含量符合規(guī)定的樣品，其紫外圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.995以上，而含量不符合規(guī)定的4批樣品，則相似度＜0.993；紅外指紋圖譜中，含量符合規(guī)定的樣品，其紅外圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.990以上，而含量不符合規(guī)定的4批樣品，則相似度＜0.980。該方法可用于腦復(fù)神液的質(zhì)量評(píng)價(jià)，其相似度值的大小可作為清腦復(fù)神液質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：清腦復(fù)神液；質(zhì)量評(píng)價(jià)；紫外指紋圖譜；紅外指紋圖譜

0　引言

清腦復(fù)神液載于WS3-B-1838——1994《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》[1]（第九冊(cè)），是由人參、黃芪、當(dāng)歸、鹿茸（去皮）、菊花、薄荷、黃芩、黃柏等48味藥材組成。具有清心安神，化痰醒腦，活血通絡(luò)的功效，臨床用于治療神經(jīng)衰弱，失眠，頑固性頭痛，腦震蕩后遺癥所致頭痛、眩暈、健忘、失眠等癥[1]。中藥指紋圖譜是指中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后采用一定的分析手段，得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖[2]。目前指紋圖譜技術(shù)已成為國(guó)際公認(rèn)的中藥及其復(fù)方質(zhì)量控制的重要手段[3]，同時(shí)對(duì)中草藥的適用性也得到了越來(lái)越多發(fā)達(dá)國(guó)家的認(rèn)可[4-5]。目前，部頒標(biāo)準(zhǔn)僅建立了大黃酚與丹參酮IIA的薄層鑒別，本課題在前期研究中，增加了枳殼、葛根、赤芍的薄層鑒別項(xiàng)以及鹽酸小檗堿、總黃酮的含量測(cè)定項(xiàng)。然而，清腦復(fù)神液為中藥大復(fù)方品種，僅幾項(xiàng)薄層鑒別及兩項(xiàng)含量測(cè)定，還不足以確保其質(zhì)量。為更好地監(jiān)控和評(píng)價(jià)本品的質(zhì)量，本研究采用紫外及紅外指紋圖譜的分析方法，計(jì)算清腦復(fù)神液樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度[6]，以期探索清腦復(fù)神液的紫外及紅外指紋圖譜與其質(zhì)量之間的內(nèi)在聯(lián)系，建立清腦復(fù)神液的紫外及紅外指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為大復(fù)方中藥的質(zhì)量控制研究提供新的思路和手段。

1　儀器與材料

UV-2300型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；PE spectrum 2紅外光譜儀（天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司）；FW-5壓片機(jī)（天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司）；瑪瑙研缽；溴化鉀（光譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

清腦復(fù)神液20批，均來(lái)自四川中方制藥有限公司。本課題前期對(duì)其鹽酸小檗堿及總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，并規(guī)定了限度。其中16批樣品符合規(guī)定（批號(hào)為131117，131118，131121，131122，131123，131124，131126，131128，131129，131152，140337，140338，140339，140341，140342，140344，其中131117，131126，131252，140337含量較高），4批樣品不符合規(guī)定（批號(hào)為140340，140343，140345，140346）。

2　方法與結(jié)果

2.1紫外指紋圖譜

2.1.1測(cè)試條件

以15%的乙醇調(diào)整基線并作為參比液進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，設(shè)定掃描波長(zhǎng)為200～900 nm，掃描速度200nm/min，狹縫寬1.5nm，采樣間隔1nm，自動(dòng)切換波長(zhǎng)340nm。

2.1.2精密度試驗(yàn)

同一批清腦復(fù)神液（批號(hào)：140337），取1份按照“2.1.1”項(xiàng)下的測(cè)試條件連續(xù)測(cè)定6次，所得紫外譜線在298，338，465，550，650nm處吸光度的RSD%分別為1.76%，0.69%，0.39%，1.93%，1.88%，均＜3%，表明儀器精密度良好。

2.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一清腦復(fù)神液（批號(hào)：140337）按照“2.1.1”項(xiàng)下的測(cè)試條件，每隔1h測(cè)定1次，結(jié)果5 h內(nèi)所得紫外譜線在298，338，465，550，650 nm處吸光度的RSD%分別為1.74%，0.66%，1.73%，1.55%，1.93%，均＜3%，表明樣品在5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4重復(fù)性試驗(yàn)

同一批清腦復(fù)神液（批號(hào)：140337），取6份按照“2.1.1”項(xiàng)下的測(cè)試條件測(cè)定，所得紫外譜線在298，338，465，550，650 nm處吸光度的RSD%分別為1.98%，0.92%，1.82%，1.56%，1.67%，均＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5清腦復(fù)神液紫外光譜采集

取20批清腦復(fù)神液樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下的測(cè)試條件分別測(cè)定，其紫外光譜疊加圖如圖1所示。

圖1　20批清腦復(fù)神液紫外光譜疊加圖

2.1.6對(duì)照紫外指紋圖譜的建立

在進(jìn)行相似度分析之前，先建立清腦復(fù)神液的對(duì)照紫外指紋圖譜，選擇在前期研究中含量符合規(guī)定的10批樣品（批號(hào)為：131117，131118，131121，131122，131123，131124，131126，131128，131129，131252），以其吸收強(qiáng)度的平均值為對(duì)照指紋圖譜的吸收強(qiáng)度，最終得到的紫外圖譜如圖2所示。

圖2　清腦復(fù)神液對(duì)照紫外指紋圖譜

2.1.7樣品指紋圖譜相似度分析

將清腦復(fù)神液樣品的紫外圖譜與得到的對(duì)照紫外指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，采用相關(guān)系數(shù)法[7-8]進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。可以看出，采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算的相似度大小與樣品的質(zhì)量狀況密切相關(guān)。前期研究中，含量符合規(guī)定的樣品，其紫外圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.995以上，且含量較高的4批樣品，其相似度均在0.999以上，而含量不符合規(guī)定的4批樣品，則其相似度＜0.993。

表1　清腦復(fù)神液紫外指紋圖譜相似度分析結(jié)果1）

2.2紅外指紋圖譜

2.2.1測(cè)試條件

用膠頭滴管取清腦復(fù)神液樣品一滴于瑪瑙研缽中，揮干，加入0.3g溴化鉀，研磨均勻，取適量研細(xì)后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測(cè)定紅外光譜，測(cè)定區(qū)域?yàn)?50～4000cm-1。

2.2.2精密度試驗(yàn)

同一批清腦復(fù)神液（批號(hào)：140338），取1份按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備并連續(xù)測(cè)定6次，所得紅外譜線在3 392，2 391，1 646，1 394，1 054 cm-1處透光率的RSD分別為2.06%，1.99%，1.45%，1.98%，2.38%，均＜3%，表明儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一清腦復(fù)神液（批號(hào)：140338）按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制得供試片，放入干燥器內(nèi)保存，每隔1 h測(cè)定1次，結(jié)果5h內(nèi)所得紅外譜線在3392，2 391，1 646，1 394，1 054 cm-1處透光率的RSD分別為1.76%，2.41%，2.05%，1.78%，1.68%，均＜3%，表明樣品在5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)

同一批清腦復(fù)神液（批號(hào)：140338），取6份并分別按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法壓片后測(cè)定，所得紅外譜線在3 392，2 391，1 646，1 394，1 054 cm-1處透光率的RSD分別為2.36%，2.01%，1.65%，1.58%，1.98%，均＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5清腦復(fù)神液紅外光譜采集

取20批清腦復(fù)神液樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備并分別測(cè)定，其紅外光譜疊加圖如圖3所示。

圖3　20批清腦復(fù)神液紅外光譜疊加圖

2.2.6對(duì)照紅外指紋圖譜的建立

在進(jìn)行相似度分析之前，先建立清腦復(fù)神液的對(duì)照紅外指紋圖譜，選擇在前期研究中含量測(cè)定符合規(guī)定的10批樣品（批號(hào)為：131117，131118，131121，131122，131123，131124，131126，131128，131129，131252），以其吸收強(qiáng)度的平均值為對(duì)照指紋圖譜的吸收強(qiáng)度，最終得到的紅外圖譜如圖4所示。

圖4　清腦復(fù)神液對(duì)照紅外指紋圖譜

2.2.7樣品指紋圖譜相似度分析

將清腦復(fù)神液樣品的紅外圖譜與得到的對(duì)照紅外指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，采用相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表2。前期研究中，含量符合規(guī)定的樣品，其紅外圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.990以上，且含量較高的4批樣品，其相似度均在0.998以上；而含量不符合規(guī)定的4批樣品，其相似度則＜0.980，與紫外指紋圖譜相似度分析結(jié)果一致。

3　結(jié)束語(yǔ)

中藥指紋圖譜是基于對(duì)中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，可以較充分地反映出中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分分布的整體狀況，已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)[9-10]。目前建立中藥指紋圖譜的方法主要有紫外光譜法[11]、紅外光譜法[12]、核磁共振法[13]、液相色譜法[14]、氣相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳法[16]等。

表2　清腦復(fù)神液紅外指紋圖譜相似度分析結(jié)果

紫外光譜可反映出中藥中化學(xué)組分π→π*、n→π*及n→σ*等化學(xué)鍵信息，由于不同的中藥體系紫外吸收曲線具有不同指紋特征，故紫外光譜指紋圖譜可用于中藥及其制劑的質(zhì)量鑒別[6]。本試驗(yàn)將清腦復(fù)神液樣品的紫外圖譜與得到的對(duì)照紫外指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示，在前期研究中，含量符合規(guī)定的樣品，其紫外圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.995以上，且含量較高的4批樣品，其相似度均在0.999以上，而含量不符合規(guī)定的4批樣品，其相似度則＜0.993。可見采用紫外指紋圖譜對(duì)清腦復(fù)神液進(jìn)行分析，其結(jié)果可以反映出樣品的質(zhì)量狀況，因此可應(yīng)用紫外指紋圖譜對(duì)清腦復(fù)神液質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

中藥紅外光譜可看作是多個(gè)純物質(zhì)的疊加，不同的中藥都有獨(dú)特的紅外光譜特征，因此紅外光譜在中藥中有較高的鑒別價(jià)值，只要復(fù)方中藥的質(zhì)和量上保持相對(duì)穩(wěn)定，紅外光譜就有一定的客觀性和可重復(fù)性[8]。本試驗(yàn)將清腦復(fù)神液樣品的紅外圖譜與得到的對(duì)照紅外指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果，在前期研究中，含量符合規(guī)定的樣品，其紅外圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.990以上，且含量較高的4批樣品，其相似度均在0.998以上，而含量不符合規(guī)定的4批樣品，其相似度則＜0.980，與紫外指紋圖譜相似度分析結(jié)果一致。因此可采用紅外指紋圖譜對(duì)清腦復(fù)神液的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究中，盡管20批清腦復(fù)神液的紫外及紅外指紋圖譜的相似度均在0.9以上，且都比較相近，然而在前期研究中含量不符合規(guī)定的4批樣品與符合規(guī)定的樣品還是有較明顯的差別，這可能與生產(chǎn)中原藥材的質(zhì)量以及投料中缺藥有關(guān)，因此采用紫外及紅外指紋圖譜對(duì)清腦復(fù)神液的質(zhì)量控制具有一定的意義。

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（編輯：莫婕）

Study on the spectrum fingerprints of Qingnaofushen oral liquid

LIU Tao1，WU Lihua1，HUANG Ying2，LI Pengcheng1，ZHANG Wenwen1，XU Yuling1
（1. Chengdu University，Chengdu 610106，China；2. Sichuan Xinzhongfang Pharmaceutical Technologies Inc.，Guangyuan 628000，China）

Abstract:To establish the evaluation methodology of Qingnaofushen oral liquid by ultraviolet and infrared fingerprints，the ultraviolet and infrared diagrams for 20 batches of Qingnaofushen oral liquid were measured through an ultraviolet visible spectrophotometer and an infrared spectrometer. Then established the ultraviolet and infrared fingerprints by using common pattern and calculated the similarity by using correlation coefficient method. The similarity between the ultraviolet fingerprints and the control fingerprints of qualified samples was above 0.995 whereas that of the four unqualified batches was below 0.993. The similarity between the infrared fingerprints and the control fingerprints of the qualified samples was higher than 0.990 while that of the four unqualified batches was lower than 0.980. It is thus demonstrated that this method can be used to evaluate the quality of Qingnaofushen oral liquid and the similarity can be regarded as an evaluating indicator.

Keywords:Qingnaofushen oral liquid；quality evaluation；ultraviolet fingerprints；infrared fingerprints

作者簡(jiǎn)介：劉濤（1976-），男，四川南充市人，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士，主要從事中成藥新藥開發(fā)及再評(píng)價(jià)工作。

基金項(xiàng)目：四川省經(jīng)信委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)基金項(xiàng)目（20141124）；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014SZ0139）

收稿日期：2015-09-14；收到修改稿日期：2015-10-20

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.02.014

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（2016）02-0063-04