淺談HA-HI試驗的影響因素及其應用

徐艷秋 黃家興

（騰沖市動物疫病預防控制中心，云南騰沖 679100）

淺談HA-HI試驗的影響因素及其應用

徐艷秋 黃家興

（騰沖市動物疫病預防控制中心，云南騰沖 679100）

血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI），簡稱“HA-HI試驗”，是目前獸醫實驗室常用的檢測方法，作為血清學診斷技術之一，廣泛用于畜牧業生產、動物疫病監測、流行病學調查、動物疫情預警、延伸績效考核等，但是影響其試驗結果的因素很多，對抗原、抗體、紅細胞、血清、稀釋液、保存液、溫度、pH值、作用時間、判定時間、試驗器材、試驗方法、操作標準等因素，對HA-HI試驗的影響進行了概述，以供同類研究和生產應用提供參考。

疫病監測；血凝試驗（HA）；血凝抑制試驗（HI）；HA-HI試驗；影響因素；應用

1 HA-HI試驗的特點

1.1 原理

許多病毒的包膜中含有按病毒密碼合成的蛋白質（凝集素），這種蛋白質有凝集某些動物紅細胞的能力，稱為紅細胞凝集，簡稱HA試驗。HA試驗能被相應的特異性抗體所抑制，阻斷病毒顆粒表面上的抗原，病毒與抗體結合形成病毒抗體結合物，加入動物紅細胞，產生抑制紅細胞凝集現象，稱為紅細胞凝集抑制試驗，簡稱HI試驗。由于這個試驗包括HA試驗、4單位抗原配制、HI試驗三個步驟，準確地講，應稱為HA-HI試驗。HA-HI試驗，是用于測定血清中的特異性抗體，或用特異性抗體鑒定所分離病毒種屬的簡單、快速、具有特異性診斷的方法。常用于HA-HI試驗檢測的動物疫病有禽流感、雞新城疫、雞減蛋綜合征、兔病毒性出血癥、豬犬細小病毒病、流行性乙腦炎、豬流行性感冒、流行性出血熱、狂犬病等[1]。

1.2 優點

由于特異性好、能進行大量樣本的分析、對試驗環境要求不高、節省試劑和易于操作、費用低等優點，主要用于禽流感、新城疫等疫病診斷、免疫狀態監測、延伸績效考核的抗體水平檢測、禽流感疫情預警等。

1.3 缺點

HA-HI試驗的缺點是：全過程為手工操作，費力費時，與ELISA相比敏感性也低，其檢測結果受諸多因素的影響。

2 HA-HI試驗的實際應用

2.1 檢測抗體水平

（1）我市禽類疫病HA-HI檢測現狀：詳見表1。

表1 騰沖市近年來雞疫病HA-HI試驗抗體檢測統計表

（2）用疫苗免疫雞群后，在正常情況下HI抗體效價保持一定的水平，如用弱毒活疫苗免疫后，HI抗體可達到1：1 6～1：64 （4log2～ 6log 2）；用油劑滅活苗，HI抗體可達到1：256～1：512（8log2～ 9log2），最高可達到1：2 048（11log2）。HI試驗作為適時免疫的檢測手段，能避免免疫失敗的發生。

2.2 疫病診斷

2.2.1 鑒定某些病毒

有些病毒能凝集動物的紅細胞，且這種特性被特異性抗血清抑制，也就是說，雞新城疫的血清只能與雞新城疫病毒發生血凝抑制現象，而不能與禽流感病毒發生血凝抑制。血清血凝抑制（HI）實驗既可用已知抗雞新城疫病毒的血清來鑒定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒來測定雞血清中是否含有特異性抗體，以確定雞群是否感染過新城疫。

2.2.2 輔助診斷某些病毒性疾病

從待檢血清中檢出抗體，或從病料中檢出病毒，以診斷病毒性傳染病，當發現HI抗體異常升高，血凝抑制效價超過11 log2時，說明該雞群可能感染了雞新城疫或禽流感，并結合臨床癥狀和剖檢變化加以確認。

2.2.3 NDHI與臨床癥狀的關系

NDHI<4 感染100%死亡；NDHI=4-7 感染發病90%不死；NDHI=6-8 感染發病100%不死；NDHI=8-10 感染產蛋下降、NDHI上升；NDHI=11-13 感染只見NDHI上升；NDHI=13-15 病毒無法侵入。

2.3 疫病凈化

根據HA-HI試驗的抗體檢測和疫病診斷的特性，可用于養雞場的禽流感、雞新城疫的監測凈化。

2.4 跟蹤監測

養禽場在疫病發生時或是在疫苗免疫后應做抗體的跟蹤監測。在每次疫苗接種后可隨機抽10%的樣本進行抗體監測，以確定本次免疫的成功情況，決定是否進行補免甚至重免。

2.5 評價高免血清

HA-HI試驗可測定新城疫或禽流感等高免血清及卵黃抗體的效價，對其進行質量評價。當抗體水平在9 log2以上時，可作緊急預防或早期用生物藥品治療。

3 HA-HI試驗的影響因素

3.1 抗原

3.1.1 選擇進購與疫苗毒株一致的診斷試劑。合理選擇抗原，免疫監測實質上是一個抗原抗體反應的過程。疫苗種毒株與抗原所用毒株相同，測得的HI效價就高。在血凝抑制試驗操作時，挑選親和型毒株作為測定抗原較好，這樣會提高診斷的靈敏度，也就是說如使用某一廠家的疫苗，最好用此廠家提供的抗原做檢測。

3.1.2 配制合適濃度的四單位抗原。按照農業部的標準檢測方法，檢測用的抗原稀釋為四個單位后還需做一次回歸實驗，即檢測四個單位的抗原是否準確，但是生產中這一步經常被省略。事實上隨著抗原濃度的增加，HI滴度逐漸下降，每增加1倍濃度，滴度下降0.9～1.1log2。

3.2 抗體與血清

血清要求不腐敗、不變質的、合適采樣時間的標準樣本。在采樣的過程中盛放樣本的試管不能污染，不能含有雜質，不能含有與抗體無關的蛋白質，也不能加抗凝劑，不能有溶血物，否則血清就不易分離或影響其抗體的效價。被檢血清必須新鮮，血樣采集后，應及時分離血清，分離好的血清應該是淡黃色、透明液體。分離后應及時測定或放置4℃冰箱內保存，保存時間不宜過長，要力求新鮮，否則影響檢測效果。

3.3 紅細胞

3.3.1 紅細胞來源：如果紅細胞來源于同一只雞，則可能產生自凝現象。因此應選擇3～4只健康雞的血液混合后制成紅細胞懸液，以減少自凝現象的干擾。這些健康雞最好是SPF級成年公雞。

3.3.2 紅細胞濃度：在生產中常用0.5～1%的紅細胞。不同濃度的紅細胞對HI效價有一定的影響，濃度大時HI值相對較小，濃度小時HI值相對較高。當濃度為1%，沉降的血點過大；濃度為0.5%，沉降的血點太小，不易判斷，沉降速度太慢。我獸醫實驗室常用1%的紅細胞。

3.3.3 紅細胞制備：為保證1%紅細胞的穩定性和濃度的準確性，離心時要掌握離心速度和離心時間，同時固定洗滌液。洗滌時要盡量除去表面的白細胞膜，洗滌次數不宜過多，肉眼觀察上清液澄清透明即可。1%紅細胞應保存于4℃，且不超過2d。新鮮紅細胞質脆易碎，不易保存，應隨配隨用。

3.3.4 紅細胞醛化：醛化紅細胞性質穩定，在蒸餾水中不溶血，不易腐敗，可在4℃條件下保存數月至1年。使用方便，反應均一、穩定，圖像清晰，結果一致和易判定等優點。而醛化紅細胞的檢測結果比新鮮紅細胞低1～2效價。

3.4 稀釋液與pH值

3.4.1 阿氏液蒸餾水和阿氏液配制是否正確，影響到1%紅細胞的配制，干擾試驗結果。

3.4.2 稀釋液在血凝試驗中，最常用稀釋液pH值為7.0～7.2的PBS緩沖液，PBS液的pH在5.8以下，紅細胞易發生自凝；pH值在7.2時，紅細胞沉降最充分，圖形最清晰，HA值最小，HI值最大。pH值在7.8以上時， 圖形洗脫加快，易造成觀察誤差。PBS液要現配現用， 配制好必須用NaoH或HCL調pH值至7.2，如果用生理鹽水代替PBS液，要使用新開瓶的滅菌生理鹽水; 稀釋液的配制時間不易過長，否則可能被環境污染，因不能保持無菌的反應環境，而使得檢測結果受到干擾，出現試驗不成立、跳孔等現象。

pH7.0～7.2PBS緩沖液測定抗原的血凝滴度比常用0.85%生理鹽水和調pH至PH7.0～7.2生理鹽水高出將近一倍，測定的陽性血清的抗體滴度高出一孔。試驗表明用PBS為稀釋液能夠降低試劑成本、提高檢出率，以PBS緩沖液的測定值最高。

3.4.3 pH值：采用PBS作稀釋液，pH<5.8時紅細胞易自凝，pH>7.8時凝集的紅細胞解凝加快，pH為7.0時紅細胞沉淀最充分，圖形最清晰。采用生理鹽水作稀釋液，pH<6.5或>7.4時，紅細胞發生溶血現象，pH為7.0時不發生溶血。因此，最佳的pH值為6.5～7.4，通常用pH值為7.0～7.2的稀釋液，最適宜雞紅細胞，效價高，且圖形清晰。

3.5 試驗器材

3.5.1 微量血凝板目前，縣級實驗室多使用有機玻璃材料的96孔凝集板，其清潔度對試驗結果有很大的影響。一般來說：試驗完畢后，應立即用清水反復沖洗，再用含有洗滌劑的溫水溶液浸泡30min，并在洗滌劑溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，待反應板干燥后，放到濃度為2～3%的鹽酸溶液中浸泡24h以上，取出后用清水沖洗多次，最后以蒸餾水沖洗2～3次，在37℃溫箱中烘干備用。使用前檢查血凝板，將其正對日光燈，孔底光潔、透明、無可見沉淀附著物為準。因微量反應板V型孔內壁應光滑，不能用試管刷等來刷洗V型孔，不潔凈的反應板會造成紅細胞的非特異性凝集，影響結果的判定， 現在多數使用一次性凝集板，這必須保持板面及凹孔的干凈及平整。

3.5.2 移液器在稀釋血清時，產生氣泡，造成移液量減少。在使用微量移液器時，吸頭要安裝牢固，防止漏氣，操作時移液吸頭應插到液面以下，手壓下的力度要均勻，否則移液量不準，造成結果偏差。在使用多道移液器時，吸取液體后觀察幾個吸頭中液面是否水平一致，有時操作不注意可能引起某個吸頭吸入量或多或少，直接影響結果測定。吸取的過程應該做到“慢吸快打”，在吸液時要慢、準，放液時對準孔后速度要快，可以避免打完后吸頭下存留液體，保證加入的液體體積一致。倍比稀釋血清時，在吸取第一孔時要先按下移液器，再插入反應板孔內，吸取后插入第二孔液面下，在反復抽取過程中，移液器吸頭不要離開液面，以防止產生氣泡，造成移液量不準。

3.5.3 吸頭加液體時，吸頭與反應板孔接觸造成樣品交叉。尤其是在最后加入紅細胞懸液時，孔內已有稀釋液、血清、抗原等，如果吸頭接觸到孔內混合液，會造成各個孔內液體相互交叉，導致試驗結果出現誤差，所以在使用移液器時，一定要保持加樣器吸頭與凝集板孔間的距離，以保證每個凝集孔內液體量和濃度準確。

3.5.4 振蕩器振蕩器工作平穩、勻速，無異常震動、抖動。否則混合液濃度不準[6]。

3.5.5 恒溫箱恒溫箱溫度能精確保持設定溫度，以保證試驗所需溫度。

3.6 操作、試驗方法與判定方法

3.6.1 操作人與人之間的操作存在一定的偏差，造成人為干擾。因此，要嚴格按《高致病性禽流感診斷技術》GB/T18936-2003、《雞新城疫檢測技術規范》GB/T16550-1996國家標準和抗原使用說明書進行試驗操作。

3.6.2 試驗方法全量法和β-微量法的原理是一致的。全量法誤差小，但操作慢、耗抗原及器材多。微量法節省抗原、測樣多。在全量法和微量法中以生理鹽水為稀釋液，以1%紅細胞懸液作反應指示劑和完全凝集抑制為判定終點的方法較好。全量法測得的HI效價較微量法約高0.5～1個效價，其靈敏度和準確度較高[2][3]。我獸醫實驗室常用β-微量法。

3.6.3 判斷方法不同的人在判斷75%、50%、25%的凝集或凝集抑制時，判斷結果差異較大，而對100%的凝集或凝集抑制基本上無差異。實際應用時一般以100%抑制為判斷終點。

4 結論

HA-HI試驗，應用廣泛，是目前獸醫實驗室常用的血清學檢測方法。HA-HI試驗的影響因素有很多，在進行試驗前應綜合考慮各方面的影響因素，選定一個適合自身實驗室條件的試驗標準，操作細心、標準，以降低試驗誤差。

[1] 畢云龍，李松柏主編.實用獸醫血清學診斷技術[M].云南省獸醫防疫總站，1994.

[2] 農業部制定.動物防疫標準匯編[M].中國標準出版社，2004.

[3] 李金福，金衛華主編.動物疫病監測與控制[M].云南科技出版社，2000.