茶葉中大腸菌群檢測方法的研究

武疆（濮陽市高等醫學專科學校（籌），河南濮陽457000）

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茶葉中大腸菌群檢測方法的研究

武疆
（濮陽市高等醫學專科學校（籌），河南濮陽457000）

摘要：本文以茶葉中大腸菌群為主要檢測目標，利用國標法、LST法以及熒光法檢測茶葉中大腸菌群總數，并比較三種檢測方法的優劣，以期為相關研究者提供數據參考與理論支持。

關鍵詞：有害生物；茶葉；大腸菌群；檢測方法

據檢測結果表明，我國現出口的茶葉產品中，有害生物的種類是沙門氏桿菌、大腸桿菌、黃曲霉毒素等，其中，沙門氏桿菌和大腸桿菌嚴重超標，黃曲霉毒素偶有檢出。另外，茶葉產品中，出現微生物污染的情況也不盡如人意。對此，不僅我國茶葉生產部門應該重視并積極解決該問題，其他相關部門如銷售部門、管理部門、檢驗檢疫部門等也應該高度重視。尤其是檢驗檢疫部門，應該不斷加強檢疫力度，積極做好各項檢測試驗。

1　材料與方法

1.1實驗材料

試驗材料：普洱、康磚、綠茶、包裝綠茶、茉莉花茶。（所有試驗用茶都必須根據茶葉的具體取樣標準進行樣品選取）

培養基：營養型瓊脂培養基、蛋白胨葡萄糖培養基、蛋白胨水培養基、枸櫞酸鹽培養基、LST肉湯、BGLB肉湯、MUGal肉湯、乳糖發酵管、乳糖膽鹽發酵管、伊紅美藍瓊脂以及革蘭氏染色劑。（LST肉湯和BGLB肉湯需要自行熬制、MUGal可直接購買）

器材用具：酒精燈、天平、培養皿、吸液球、蓋玻片、載玻片、量筒、濾紙、紗布、漏斗、接種環、脫脂棉、溫度計、玻棒、膠頭吸管、試管、移液管、手術剪、250ml的燒杯、50ml、250ml、1000ml的三角燒瓶等。

實驗器材：SW-CJ-1A型號的凈化水平流工作臺（江蘇省凈化設備有限公司）、B11.500-S恒溫電熱培養箱（江蘇省常熟醫療儀器有限公司）、S.C 101-1電熱鼓風干燥箱（上海市高機實業有限公司）、21CR6恒溫電熱水浴鍋（廣東醫療器械有限公司）、YXQ.SG41.280手提電熱蒸汽壓力消毒器（哈爾濱市松江醫療器械有限公司）、HZQQX全溫度振蕩器（上海市博訊事業醫療設備有限公司）、A13204-N分析天平（上海市第二天平有限公司）、LG-2.4A離心機（北京市醫療用具有限公司）、OLYMUPUS顯微鏡（Olymupus Co.LTD）、pHS-25型號的數字化PH計（上海市雷諾試驗儀器有限公司）、HITACHIU-1800型號的分光光度計、BCD-216YH型號的海爾冰箱、SG-280型號的粉碎機、電爐等。

1.2試驗方法

樣品檢驗處理：在無菌操作下，利用粉碎機將各種類的取樣茶葉打碎，然后利用無菌包裝袋進行密封并有效保存。

測定茶葉樣品中菌落總數：①選擇并確定茶葉的實際稀釋度：在無菌操作下，稱各種類茶葉樣品25g，利用粉碎機打碎后，放置于250ml的三角燒瓶中，分別加入225ml無菌水對其進行稀釋，稀釋至均質為10-1溶液。然后在以10倍的標準進行梯度稀釋，分別稀釋完成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等六個梯度溶液。從每個溶液濃度中移取1ml，然后滴入平皿，將營養型瓊脂倒入，放置進入恒溫培養箱，溫度設置在36℃正負1℃的范圍內進行恒溫培養。48h之后進行菌落數量觀察，根據實際的菌落數選擇并確定三個合適的稀釋度。②測定菌落總數：在無菌條件下，根據最后確定的三個茶葉稀釋度，各吸取1ml滴入培養皿，迅速倒入溫度適合的營養型培養瓊脂。對每個茶葉稀釋度進行三次重復，然后放入溫度設置在36℃正負1℃范圍內的恒溫培養箱中進行菌落培養。48h之后，再進行菌落觀察并記錄試驗結果。

檢驗大腸菌群的方法：大腸菌群，其實是指要么具有某些特性，要么與糞便污染相關的一組或一群細菌。通常屬于需氧型細菌或兼性厭氧型細菌，大多數在37℃時，能夠將乳糖進行分解，并形成能夠產酸也能夠產氣的無芽孢桿菌，并且這些菌都屬于革蘭氏陰性菌。故此，對大腸菌落進行檢測時，都需要按照其既定定義進行。就目前來看，我國對進出口食物進行大腸菌落檢測時采用的方法主要有三種，分別是國標法、LST法以及熒光法。

1.2.1國標法：即國家標準，通常采用三步法進行大腸菌落檢測，分別是乳糖發酵、分離培養以及證實等試驗。（1）乳糖發酵試驗：在茶葉樣品稀釋完成之后，選擇三個適宜的稀釋度，在每一個稀釋度上接種乳糖膽鹽發酵管，每個需接種三管，放置進溫度設置在36℃正負1℃范圍內的恒溫培養箱中培養46-48h。在此過程中，需要觀察其是否有氣體產生。（2）分離培養試驗：對有氣體產生的發酵管進行處理，將其對應培養物轉移接種在伊紅美藍的瓊脂平板之上，放置進溫度設置在36℃正負1℃范圍內的恒溫培養箱中培養18-24h。在此過程中，需要不斷觀察其菌落的具體形態。（3）證實試驗：對平板上相對可以的菌落進行深入分析，將其挑起進行革蘭氏染色試驗，觀察具體情況。同時，對其進行乳糖發酵管接種，接種完成后放置于溫度設置為36℃正負1℃范圍內的恒溫培養箱中培養22-26h。在此過程中，也必須觀察其是否產氣。

國標法檢測完成之后，撰寫報告時，必須證實大腸桿菌中陽性菌的具體管數。同時，還需要查詢MPN表，將每100ml/g大腸菌群的實際MPN值進行核對并報告。

1.2.2LST法：即國家商業檢疫局原來制定并采用的行業標準，與美國PDA制定并采用的標準方法效果相同。該方法主要包括兩個試驗，分別是推測和證實試驗。（1）推測試驗：對茶葉樣品稀釋完成之后，選擇三個適應的稀釋度，在每個稀釋度上接種LST肉湯，每個需接種三管。接種完成之后，將培養皿放置于溫度設置在36℃正負1℃范圍內的恒溫培養箱中培養46-50h。在此過程中，需要切實觀察培養皿是否有氣體產生。（2）證實試驗：對有氣體產生的LST肉湯管進行處理，在其培養物上接種BGLB肉湯管。接種完成之后，將其放置于溫度設置為36℃正負1℃范圍內的恒溫培養箱中培養46-50h。在此過程中，同樣需要切實觀察培養皿是否有氣體產生。

LST法檢測完成之后，由于BGLB產生的氣體為陽性，所以同樣需要查詢MPN表，將樣品茶葉中每ml/g含有大腸菌群的實際MPN值。

1.2.3熒光法：即快速檢測大腸菌群的標準，主要包括三個試驗，分別是推測、對照、證實等試驗。（1）推測試驗：在雙料管中滴加比例為1∶10的樣品稀釋溶液，重復三管；移取比例為1∶10的樣品稀釋溶液滴加到MUGal肉湯之中，重復三管；移取比例為1∶10的樣品稀釋溶液滴加到MUGal肉湯的單料中，重復三管。將所有試管放置于溫度設置在37℃的恒溫培養箱中培養24h。然后利用波長為366nm的紫外線進行照射，若呈現的熒光反應為蘭色，則大腸菌群為陽性。（2）對照試驗：設置一個空白對照的試管，在MUGal肉湯中加入無菌形態下的生理鹽水，后續步驟按照推測試驗進行。（3）證實試驗：設置陽性和陰性的對照菌管各一個。陽性對照管為MUGal肉湯中滴加大腸桿菌，陰性對照管為MUGal肉湯中滴加沙門氏菌。將所有對照管放置進溫度設置為37℃的恒溫培養箱中培養24h。培養完成之后，將試驗管放置于黑暗之處，用波長為366nm的紫外燈進行照射。如果熒光反應為蘭色，則大腸菌群為陽性；如果熒光反應不是蘭色，則大腸菌群為陰性。

熒光法檢測完成之后，與國標法和LST法一樣，同樣需要查詢MPN表，進行檢測報告完成。

2　結果與分析

2.1茶葉樣品中菌落總數的調查

不同種類的茶葉細菌總數進行抽樣檢查表明：茶葉產品整體情況較好。由上表可知：茉莉花茶和綠茶的茶湯在前三個稀釋度中的菌落總數正隨著這稀釋度的遞增而不斷增加，且該趨勢越發顯著；而普洱和康磚則與之不同，在稀釋度不斷增加的同時，其茶湯稀釋度中的菌落總數反而不斷減少，但這一趨勢變化具有一定程度的滯后性。該滯后性產生的原因可能是由于茶葉中存在多酚類物質。茶葉中存在的多酚類物質有較強的殺菌作用，故此，在高濃度的茶葉中，能夠檢測到細菌的總數會很少。另外，由于茶葉檢測的意義在于低濃度茶葉樣品中菌落總數的數值必須小于1％，所以，對茶葉中所含微生物進行計數時，選擇的適宜稀釋度應該為10-2、10-3以及10-4。

由試驗的整體結果顯示：所有茶葉樣品的菌落總數均在2000cfu/ml至200000cfu/ml范圍內。且按照茶葉所受污染的具體程度進行遞減排序，各類茶葉的順序為康磚＞普洱＞茉莉花茶＞綠茶＞包裝綠茶。其中，由于普洱和康磚都是黑茶，且需要必要的發酵生產，所以受到微生物污染的侵染較為嚴重，其侵染途徑也相對要比其他茶葉的途徑多。另外，花茶屬于再加工茶品，所以，受到微生物污染和侵害的途徑也相對較多。由此，這幾種茶的細菌總數相對綠茶而言，都較高。

2.2不同方法檢測各類茶葉大腸菌落的對比分析

就傳統的大腸菌落檢測方法而言，其準備工作異常繁瑣，且試驗過程耗時較長，最少需72h。相比而言，熒光法只需24h，簡單快捷。下圖是國標法、LST法以及熒光法對茶葉中大腸菌落的具體檢測結果：

雖然在統計學上，國標法和LST法與熒光法之間沒有顯著性差異，且LST法在茶葉大腸菌群的檢測中具有很好的檢出性，但是前兩者檢出的大腸菌群在數量上明顯多過熒光法檢出的。分析原因，是受到茶樣中自身內含物影響或干擾所致，但都沒有產生非特異性反應。另外，在試驗過程中，出現有試管本身帶有熒光的現象，這可能是由于試管本身沒有清洗干凈或是殘留物等影響。除此之外，茶葉成分復雜，茶樣顆粒較大、或壞死pH值過高等，都會對整個檢測試驗產生干擾。

參考文獻

[1]王立波等.茶葉中大腸菌群檢測方法初步比較[J].中國茶葉, 2010,07:19-20.

[2]陳利燕等.茶葉中大腸菌群的污染途徑初探[J].中國茶葉加工, 2005,01:36-37.

作者簡介：武疆（1982-），女，山西長治人，碩士，講師，研究方向：生物學、微生物。