正交實驗法優選丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝

李利華

(陜西理工大學 化學與環境科學學院，陜西 漢中 723000)

丁香(Eugeniacaryophyllata)，為桃金娘科蒲桃屬熱帶植物丁香的干燥花蕾，又稱公丁香。丁香原產于印度尼西亞、馬來西亞、坦桑尼亞等地，自20世紀50年代引入我國南方地區栽培，其花蕾為重要的食用香辛調料和中藥材[1]。祖國醫學認為[2]，丁香性味辛、溫，歸脾、胃、肺、腎經，具有溫中降逆、散寒止痛、補腎助陽的功效。現代研究表明[3]：丁香中含有揮發油、黃酮、多酚等多種活性成分，具有抑菌、鎮痛、麻醉、抗氧化和抗癌等生物活性。目前，有關丁香中揮發油的研究已有相關的報道[4,5]，而關于丁香中黃酮類物質提取的研究報道較少。

黃酮類化合物(Flavonoids)是一類廣泛存在于植物的根、莖、果、葉、皮中的次生代謝產物，多數與糖類結合成甙而存在的天然有機化合物[6]。近年來已有研究證實[7，8]，黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，能夠有效阻斷人體脂質自氧化，清除體內過量自由基，延緩機體衰老等，是目前研究的熱點。本研究采用超聲波輔助法提取丁香中的黃酮類化合物，先通過考察丁香總黃酮提取的4個主要影響因素：提取劑(乙醇)濃度、提取溫度、料液比和提取時間對丁香總黃酮提取率的影響，再采用正交實驗法優化丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝參數條件，皆為丁香總黃酮的開發利用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香：購自漢中市健康大藥房，經陜西理工大學生物系李新生教授鑒定為桃金娘科蒲桃屬熱帶植物丁香的干燥花蕾。

蘆丁標準品：優級純，購自中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等：以上試劑均為國產分析純；實驗用水：二次蒸餾水。

KQ-700VDE三頻式超聲波處理器 昆山超聲儀器公司；UV型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TD-214型電子分析天平 北京梅特勒-托利多儀器有限公司；中草藥粉碎機 河北宏博中藥機械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丁香總黃酮提取工藝流程

丁香清洗→低溫烘干至恒質量→粉碎→石油醚脫脂、脫色→揮發盡溶劑→乙醇浸提總黃酮→真空抽濾→測定提取液吸光度→真空干燥得丁香粗總黃酮。

1.2.2 丁香總黃酮提取率的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[9]，以蘆丁為標準對照品，于510 nm處測定吸光度值，以吸光度值(A)為縱坐標、總黃酮含量(C)為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程：A=1.077C+0.135，R=0.9986。

精密移取丁香總黃酮浸提液1.0 mL于10 mL比色管中，分別加入10%的NaNO20.3 mL，10%的Al(NO3)30.3 mL， 4%的NaOH 4.0 mL，以60%乙醇補足至刻度線，室溫下反應15 min，利用紫外-可見分光光度計在波長510 nm下測定吸光度A，代入標準曲線方程計算總黃酮含量，并計算總黃酮浸提率，每個樣品做3份重復。

1.2.3 單因素實驗設計

以丁香總黃酮提取率為衡量指標，恒定超聲波功率280 W，分別考察4個主要因素：乙醇濃度(40%，50%，60%，70%，80%，90%)、料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、提取溫度(40，50，60，70，80，90 ℃)和提取時間(30，45，60，75，90，105 min)對丁香中黃酮類物質提取率的影響，每個處理做3份平行，選取各因素的適宜水平范圍。

1.2.4 正交實驗設計

由單因素實驗結果，利用L9(34)正交實驗表[10]，優化丁香總黃酮的超聲波輔助提取最佳工藝參數條件，因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平

1.2.5 實驗數據處理

使用Origin 8.0和SPSS 17.0處理數據并做圖。

2 結果與分析

2.1 單因素結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

圖1 乙醇濃度對提取率的影響

由圖1可知，乙醇濃度在40%～70%范圍內，丁香總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大呈上升趨勢，且在乙醇濃度70%時提取率最高，為8.25%；而當乙醇濃度高于70%后，總黃酮提取率有所下降；這可能是濃度為70%的乙醇與丁香總黃酮的親和能力最強，促使丁香總黃酮最大限度地溶出。因此，乙醇濃度選擇70%左右為最佳濃度條件。

2.1.2 提取溫度對提取率的影響

圖2 提取溫度對提取率的影響

由圖2可知，在40～70 ℃范圍內，丁香總黃酮的提取率隨著提取溫度的升高明顯增加，提取溫度為70 ℃時總黃酮提取率達最大值，為7.98%，之后提取溫度繼續升高，總黃酮提取率開始下降，90 ℃時總黃酮提取率僅為6.79%。這說明適度升溫加快了分子的擴散速度，有利于丁香總黃酮的浸出；而提取溫度過高一方面會引起乙醇溶劑的揮發，另一方面高溫會使丁香中雜質的溶出量增加，導致丁香總黃酮提取率下降。因此，選擇提取溫度70 ℃左右。

2.1.3 料液比對提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可知，在料液比由1∶10增加到1∶30過程中，丁香總黃酮提取率上升較快，說明適度增大提取劑的用量有利于原料和提取劑的充分接觸，增加濃度的梯度差，從而提高其提取率；在料液比1∶30～1∶40過程中，丁香總黃酮提取率增大幅度較少，且在料液比1∶40時提取率達最大值7.55%，之后提取率逐漸下降；這可能是當總黃酮溶出已基本飽和后，再增大提取劑用量會使其他雜質的溶出增多，影響總黃酮的提取率。因此，選擇料液比為1∶40左右。

2.1.4 提取時間對提取率的影響

圖4 提取時間對提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長，丁香總黃酮的提取率呈現先上升后下降的趨勢，在提取時間為75 min時丁香總黃酮提取率最高，為7.43%，提取時間超過75 min，丁香總黃酮提取率逐漸下降。這說明適當延長提取時間，有利于丁香總黃酮活性成分在溶劑中的充分擴散和溶出，而提取時間過長，會使溶液中已溶出的總黃酮物質分解，從而導致丁香總黃酮提取率的下降。因此，選用提取時間75 min左右。

2.2 正交實驗結果及分析

表2 正交實驗結果

由表2可知,A(乙醇濃度)對丁香總黃酮的提取率影響最大，其次是B(提取溫度)，D(提取時間)對丁香總黃酮提取率影響最小，優化得到的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3，即：乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，料液比1∶40，提取時間90 min。

表3 方差分析表

由表3可知，4個因素中A(乙醇濃度)對丁香總黃酮的提取率具有顯著性影響，其他3個因素均無顯著性影響。

2.3 驗證實驗

因利用L9(34)正交實驗優化得到的丁香總黃酮最佳提取工藝條件與表2中的9組實驗不重復，故通過驗證實驗考察該工藝條件的穩定性，在最佳工藝條件下(乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，料液比1∶40，提取時間90 min)提取丁香總黃酮，并測定總黃酮提取率，制備3份平行試樣，得到丁香總黃酮平均提取率為(8.51±0.03)%，高于正交實驗設計中的9組總黃酮提取率數值，表明該工藝條件比較穩定，可以作為丁香總黃酮的超聲波輔助提取的最佳工藝條件。

3 結論

本研究通過單因素實驗和正交實驗設計對丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝進行優化。實驗結果表明：乙醇濃度對丁香總黃酮的提取達到顯著性水平，優化得到的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，料液比1∶40，提取時間90 min；驗證實驗結果顯示：在優化得到的最佳工藝條件下，丁香總黃酮提取率為(8.51±0.03)%，高于正交實驗設計表中的數值，表明該工藝條件穩定，可以作為丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝條件，為丁香總黃酮的工業化生產提供一定的數據參考，為丁香資源的進一步開發利用提供了理論依據。

參考文獻：

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