野黃芩苷體外促成骨分化作用研究

趙曉麗，陳金晶，司書毅，陳琳峰，王真

?

野黃芩苷體外促成骨分化作用研究

趙曉麗*，陳金晶*，司書毅，陳琳峰，王真

【摘要】

目的研究野黃芩苷的體外促成骨分化作用。

方法利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測野黃芩苷對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 bmp2 啟動子的 MC3T3-bmp2-Luc 細(xì)胞中 bmp2 轉(zhuǎn)錄活性的影響；體外培養(yǎng)小鼠顱骨來源的前體成骨細(xì)胞系MC3T3-E1 和小鼠多能間充質(zhì)干細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞C3H10T1/2，采用 MTT 的方法檢測野黃芩苷對細(xì)胞增殖的影響；p-NPP 法檢測野黃芩苷對成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性的影響以及通過茜素紅染色的方法考察野黃芩苷對鈣化結(jié)節(jié)形成的影響；Real-time PCR 進一步驗證野黃芩苷長時間誘導(dǎo)后對成骨細(xì)胞 bmp2 mRNA 水平的影響。

結(jié)果野黃芩苷可以在 20 μmol/L 顯著上調(diào) bmp2 轉(zhuǎn)錄活性（P < 0.001）；在 1 ～ 20 μmol/L 的劑量濃度范圍內(nèi)，野黃芩苷作用 72 h 后對 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖不明顯但也無殺傷作用。野黃芩苷在兩種實驗用細(xì)胞中均能劑量依賴地上調(diào) ALP 的活性，其中 10 μmol/L 和 20 μmol/L 最為顯著（P < 0.05），并且在 C3H10T1/2 細(xì)胞中該作用呈時間依賴性。同時也觀察到 24 d 誘導(dǎo)后，野黃芩苷（5 ～ 10 μmol/L）可以增加成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目，且誘導(dǎo) 12 d 后，在5 ～ 20 μmol/L 濃度下上調(diào) bmp2 mRNA 的水平。

結(jié)論野黃芩苷具有體外促成骨分化的活性，有潛力成為抗骨質(zhì)疏松候選化合物。

【關(guān)鍵詞】骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì) 2；堿性磷酸酶；成骨分化；野黃芩苷

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(1):27-31

作者單位：100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（趙曉麗、司書毅、王真）；IL 61801，美國伊利諾伊大學(xué)香檳分校生化系（陳金晶、陳琳峰）

*同為第一作者

成骨細(xì)胞的增殖和分化受多種因素調(diào)節(jié)，其中骨形態(tài)形成蛋白家族尤其是骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 （BMP2）在成骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用[1-2]，其作為骨形成誘導(dǎo)因子可能成為骨質(zhì)疏松治療的新靶點。Mundy 等[3]從以 BMP2 為靶點構(gòu)建的篩選模型中發(fā)現(xiàn)他汀類藥物是有效的 BMP2 上調(diào)劑，能刺激體內(nèi)的骨形成。此外，一些天然化合物，包括蛇床子素、橙皮素和大豆苷等也都能通過BMP 通路發(fā)揮對骨代謝的保護性作用[4-6]，本研究所重點室在前期工作中，成功構(gòu)建了以 bmp2 啟動子為靶點、含有螢火蟲熒光素酶報告基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，可供抗骨質(zhì)疏松候選化合物的篩選[7]。實驗中發(fā)現(xiàn)野黃芩苷（scutellarin，Scu）（結(jié)構(gòu)式見圖1）可以上調(diào)模型中 bmp2 轉(zhuǎn)錄活性，提示它可能具有促進成骨分化的活性。野黃芩苷與黃芩苷的結(jié)構(gòu)有相似性。黃芩苷誘導(dǎo)原代成骨細(xì)胞分化[8]的研究已有報道，但野黃芩苷在這一領(lǐng)域的研究尚屬空白。所以在后期實驗中，采用小鼠顱骨來源的前體成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1 和小鼠多能間充質(zhì)干細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞 C3H10T1/2，進一步研究了野黃芩苷在細(xì)胞水平誘導(dǎo)成骨分化的效應(yīng)。

圖1　野黃芩苷結(jié)構(gòu)式Figure 1　The structure of scutellarin

1　材料與方法

1.1材料

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 bmp2 啟動子的 MC3T3-bmp2-Luc細(xì)胞由司書毅教授課題組提供；Luciferase assay system 熒光素酶檢測試劑盒購自美國 Promega 公司。野黃芩苷購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；β-甘油磷酸、L-抗壞血酸、地塞米松、p-NPP （P4744）、二乙醇胺（D8885）、茜素紅均購自Sigma-Aldrich 中國公司；四甲基噻唑藍（MTT）粉末購自美國 Amresco 公司，溶于水配成 5 mg/ml的儲備液；Trizol（15596-018）購自美國 Life Technologies 公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自美國 Thermo Scientific 公司；Fast start universalSYBR green master mix 購自瑞士 Roche 公司；5 × PimeScript RT master mix 購自日本 Takara 公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及成骨分化的誘導(dǎo)C3H10T1/2 用 MEM 培養(yǎng)基，MC3T3-E1 用 α-MEM 培養(yǎng)基。各種培養(yǎng)基均加入 10%（v/v）胎牛血清、100 U/ml青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素以制成完全培養(yǎng)液。細(xì)胞在含有 5% CO2的 37 ℃ 恒溫箱中孵育培養(yǎng)。MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)液配方：完全培養(yǎng)液，25 μg/ml L-抗壞血酸、5 mmol/L β-甘油磷酸。C3H10T1/2 細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)液配方：完全培養(yǎng)液，25 μg/ml L-抗壞血酸、5 mmol/L β-甘油磷酸，10 nmol/L 地塞米松。

1.2.2利用 bmp2 表達上調(diào)劑模型評價化合物活性消化對數(shù)生長期的模型細(xì)胞 MC3T3-bmp2-Luc，按每孔 5 × 104個接種至白壁透明底 96 孔板中。待細(xì)胞充分貼壁后，加入終濃度為 20 μmol/L野黃芩苷，以與待測樣品相同濃度的 DMSO 為空白對照。作用 48 h后移去培養(yǎng)基，使用熒光酶標(biāo)儀測定熒光素酶活性。按如下公式計算待測樣品對熒光素酶活性的相對上調(diào)率：

相對上調(diào)率（%）=（S/B）× 100%（S：待測樣品組細(xì)胞熒光素酶活性；B：空白對照組細(xì)胞熒光素酶活性）。

1.2.3MTT 測定細(xì)胞活力96 孔板每孔接種細(xì)胞懸液 100 μl，3000 個細(xì)胞，以完全培養(yǎng)液為空白對照。細(xì)胞接種后，培養(yǎng) 24 h。稀釋野黃芩苷（1 ～ 20 μmol/L），配制濃度應(yīng)設(shè)為工作濃度的2 倍，每孔加 100 μl 配制的藥液連續(xù)培養(yǎng) 72 h后，每孔加入 20 μl 的 MTT 溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。用低速的真空泵吸出，每孔加 150 μl 的 DMSO，室溫振蕩 10 min 后，在 570 nm 處測定 OD 值。計算時需要減去空白對照。

1.2.4堿性磷酸酶活性檢測細(xì)胞接種于 6 孔板，3 × 105/孔，待細(xì)胞生長匯合后，換為成骨誘導(dǎo)液，并且加入不同濃度野黃芩苷，每隔 3 天換液，在指定日收集樣品。收樣時，細(xì)胞用冰冷的 PBS 清洗 2 遍，再用 1 ml 超純水清洗，吸凈液體，每孔加入 1 ml 超純水，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 2 ml EP 管內(nèi)。冰上超聲 30 s，共 2 次。所得細(xì)胞裂解液于 4 ℃，12 000 r/min 離心 15 min；轉(zhuǎn)移上清液至新的預(yù)冷 EP 管內(nèi)。取 100 μl 蛋白上清液，加 100 μl 新鮮配制的 p-NPP 溶液（1.0 mg/ml

p-NPP，1 mol/L 二乙醇胺緩沖液，0.5 mmol/L MgCl2）；另外取 100 μl 蛋白上清液，加 100 μl BCA 反應(yīng)液（方法按照試劑盒說明書），于 37 ℃孵育 30 min，堿性磷酸酶（ALP）測定孔加 50 μl濃度為 3 mol/L 的 NaOH 終止反應(yīng)，于 405 nm 處測定 ALP 反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯酚的光密度，570 nm處測定蛋白與 BCA 液反應(yīng)后的光密度。相對堿性磷酸酶活性（%）= 加藥組（OD405/OD570）/對照組（OD405/OD570）× 100%。

1.2.5鈣化結(jié)節(jié)形成檢測細(xì)胞接種于 6 孔板，2 × 105/孔以不同濃度野黃芩苷（5、10 μmol/L）處理 C3H10T1/2 細(xì)胞，培養(yǎng) 24 d 后，茜素紅染色檢測鈣化結(jié)節(jié)形成。用掃描儀掃描圖像。

1.2.6Real-time PCR 考察野黃芩苷對細(xì)胞 bmp2 mRNA 水平的影響以不同濃度野黃芩苷（5、10、20 μmol/L）成骨誘導(dǎo) MC3T3-E1 細(xì)胞 12 d，Trizol法提取細(xì)胞總 RNA。使用 5 × PimeScript RT master mix逆轉(zhuǎn)錄 PCR 獲得 cDNA。Fast start universal SYBR green master mix 法熒光實時定量，采用 2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析。引物設(shè)計如表1。

表1　引物序列Table 1　Primer sequences

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

每次實驗至少重復(fù) 2 次，數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用 Student's t 檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2　結(jié)果

2.1野黃芩苷對模型細(xì)胞中 bmp2 的上調(diào)作用

應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 bmp2 啟動子的 MC3T3-bmp2-Luc 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)野黃芩苷能有效上調(diào) bmp2 的轉(zhuǎn)錄活性，其中 20 μmol/L 野黃芩苷能使 bmp2 轉(zhuǎn)錄活性上調(diào) 29.2%（圖2），提示它可能具有潛在促成骨分化作用。

圖2　野黃芩苷上調(diào)模型細(xì)胞 MC3T3-bmp2-Luc 中 bmp2轉(zhuǎn)錄活性（***P < 0.001）Figure 2　The effect of scutellarin on the transcription of bmp2 promoter in MC3T3-bmp2-Luc (***P < 0.001)

圖3　野黃芩苷對細(xì)胞增殖的影響Figure 3　Effect of scutellarin on the proliferation of MC3T3-E1 cells

2.2野黃芩苷對細(xì)胞增殖的影響

在 1 ～ 20 μmol/L 的劑量濃度范圍內(nèi)，作用72 h，野黃芩苷并不影響 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖，也不會引起細(xì)胞死亡（圖3）。

2.3對成骨細(xì)胞的促分化作用

堿性磷酸酶活性增強及細(xì)胞外基質(zhì)鈣化是成骨細(xì)胞分化的兩個重要標(biāo)志。ALP 活性檢測結(jié)果顯示，在 MC3T3-E1 細(xì)胞中，野黃芩苷能以劑量依賴的方式上調(diào) ALP 的活性，經(jīng) 18 d 的誘導(dǎo)后，10 和 20 μmol/L 劑量下的野黃芩苷具有顯著性作用（P < 0.01，P < 0.05），20 μmol/L 的野黃芩苷引起最高上調(diào)率達 33.4%；在 C3H10T1/2 細(xì)胞中，野黃芩苷同樣能以時間依賴和劑量依賴的方式增強 ALP的活性，其中經(jīng) 18 d 的誘導(dǎo)后，10 和 20 μmol/L劑量下的野黃芩苷具有顯著性作用（P < 0.05），20 μmol/L 野黃芩苷處理組 ALP 上調(diào)達 34.6%（圖4）。

圖4　野黃芩苷上調(diào) MC3T3-E1（A）和 C3H10T1/2（B）細(xì)胞中的堿性磷酸酶活性（*P < 0.05，**P < 0.01）Figure 4　Scutellarin up-regulates the ALP activity in the MC3T3-E1 (A) cells and C3H10T1/2 (B) cells (*P < 0.05,**P < 0.01)

圖5　野黃芩苷增加鈣化結(jié)節(jié)的形成Figure 5　Scutellarin promotes the formation of calcified nodules in the C3H10T1/2 cells

鈣化結(jié)節(jié)形成檢測結(jié)果（圖5）顯示，在成骨誘導(dǎo) C3H10T1/2 細(xì)胞 24 d 后，野黃芩苷能在 5 ～ 10 μmol/L 濃度下增加鈣化結(jié)節(jié)的形成。

2.4對 bmp2 mRNA 表達的影響

野黃芩苷除了能在早期誘導(dǎo) bmp2 轉(zhuǎn)錄上調(diào)外，長時間誘導(dǎo)過程中仍能保持上調(diào) bmp2 轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)，表現(xiàn)為野黃芩苷（5、10、20 μmol/L）處理MC3T3-E1 細(xì)胞 12 d 后，bmp2 mRNA 表達增加了 2.3 ～ 2.6 倍（圖6）。

圖6　野黃芩苷上調(diào) MC3T3-E1 細(xì)胞中 bmp2 mRNA水平Figure 6 Scutellarin up-regulates the expression of bmp2 mRNA in the MC3T3-E1 cells

3　討論

骨質(zhì)疏松是一個世界范圍的健康問題，篩選安全有效的抗骨質(zhì)疏松藥物具有重要意義。由于天然化合物的結(jié)構(gòu)新穎，功能多效，不良反應(yīng)少，已成為新藥研究的主要源泉之一。

黃酮類化合物是一類在各種蔬果和草藥中常見的天然化合物，作為生物活性分子，可改善絕經(jīng)后婦女因雌激素不足而產(chǎn)生的各種不利影響，被譽為“植物雌激素”。野黃芩苷屬于黃酮類化合物，其誘導(dǎo)成骨分化的效應(yīng)在本研究中首次被發(fā)現(xiàn)。事實上，黃酮類化合物調(diào)節(jié)骨代謝的能力已被廣泛報道，其中包括淫羊藿苷、蕓香苷、柚苷和染料木素等[9-12]。

野黃芩苷是黃酮類化合物，為燈盞花素的主要活性成分。本研究發(fā)現(xiàn)，野黃芩苷在兩種體外實驗用細(xì)胞中均能劑量依賴地上調(diào) ALP 的活性，其中10、20 μmol/L 最為顯著（P < 0.05），并且在C3H10T1/2 細(xì)胞中作用呈時間依賴性。同時也觀察到 24 d 誘導(dǎo)后，野黃芩苷（5 ～ 10 μmol/L）可以增加成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目，表現(xiàn)出誘導(dǎo)成骨分化的活性。目前，野黃芩苷主要用于治療腦血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)，野黃芩苷還具有抗凋亡，抗氧化，抗炎等作用[13-15]。野黃芩苷除了具有廣泛的藥理學(xué)活性以外，其另一特性是毒性低或者幾乎沒有毒性。在急性毒性研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠對野黃芩苷的最大耐受劑量超過 10 g/kg；在亞急性毒性研究中，給大鼠每日口服 100 mg/kg 和 500 mg/kg 劑量的野黃芩苷，連續(xù)給藥 30 d 并不引起死亡或顯著的血液或尿液指標(biāo)的變化[16]。因此，野黃芩苷如能成為藥物，其應(yīng)用于治療時安全范圍比較廣。

本研究中發(fā)現(xiàn)野黃芩苷可以上調(diào) BMP2 轉(zhuǎn)錄活性和 mRNA 表達水平，野黃芩苷可能通過激活BMP 通路進而誘導(dǎo)成骨分化，對其機制研究提供一定的思路。同時，由于黃酮類抗骨質(zhì)疏松的活性研究已取得一定的成果，以后對野黃芩苷抗骨質(zhì)疏松的深入研究也可以參考黃酮類化合物的研究，相應(yīng)地，對野黃芩苷的研究可以豐富黃酮類化合物的理論研究，甚至可能發(fā)現(xiàn)新的作用機制。

參考文獻

[1] Aybar B, Emes Y, Atalay B, et al. Effects of bone morphogenetic protein on neonatal rat calvarial osteoblast-like cells: an in vitro study. J Biomed Mater Res A, 2008, 86(2):560-568.

[2] Miron RJ, Saulacic N, Buser D, et al. Osteoblast proliferation and differentiation on a barrier membrane in combination with BMP2 and TGFβ1. Clin Oral Investig, 2013, 17(3):981-988.

[3] Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science, 1999, 286(5446):1946-1949.

[4] Tang DZ, Hou W, Zhou Q, et al. Osthole stimulates osteoblast differentiation and bone formation by activation of beta-catenin-BMP signaling. J Bone Miner Res, 2010, 25(6):1234-1245.

[5] Trzeciakiewicz A, Habauzit V, Mercier S, et al. Hesperetin stimulates differentiation of primary rat osteoblasts involving the BMP signalling pathway. J Nutr Biochem, 2010, 21(5):424-431.

[6] Kim MB, Song Y, Hwang JK. Kirenol stimulates osteoblast differentiation through activation of the BMP and Wnt/β-catenin signaling pathways in MC3T3-E1 cells. Fitoterapia, 2014, 98:59-65.

[7] Li X, Yang J, He X, et al. Identification of upregulators of BMP2 expression via high-throughput screening of a synthetic and natural compound library. J Biomol Screen, 2009, 14(10):1251-1256.

[8] Guo AJ, Choi RC, Cheung AW, et al. Baicalin, a flavone, induces the differentiation of cultured osteoblasts: an action via the Wnt/beta-catenin signaling pathway. J Biol Chem, 2011, 286(32): 27882-27893.

[9] King TJ, Shandala T, Lee AM, et al. Potential effects of phytoestrogen genistein in modulating acute methotrexate chemotherapy-induced osteoclastogenesis and bone damage in rats. Int J Mol Sci, 2015, 16(8):18293-18311.

[10] Wu JB, Fong YC, Tsai HY, et al. Naringin-induced bone morphogenetic protein-2 expression via PI3K, Akt, c-Fos/c-Jun andAP-1 pathway in osteoblasts. Eur J Pharmacol, 2008, 588(2-3):333-341.

[11] Hyun H, Park H, Jeong J, et al. Effects of watercress containing rutin and rutin alone on the proliferation and osteogenic differentiation of human osteoblast-like MG-63 cells. Korean J Physiol Pharmacol, 2014, 18(4):347-352.

[12] Qin S, Zhou W, Liu S, et al. Icariin stimulates the proliferation of rat bone mesenchymal stem cells via ERK and p38 MAPK signaling. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(5):7125-7133.

[13] Feng Y, Zhang S, Tu J, et al. Novel function of scutellarin in inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis of human Burkitt lymphoma Namalwa cells. Leuk Lymphoma, 2012, 53(12):2456-2464. [14] Guo LL, Guan ZZ, Huang Y, et al. The neurotoxicity of β-amyloid peptide toward rat brain is associated with enhanced oxidative stress, inflammation and apoptosis, all of which can be attenuated by scutellarin. Exp Toxicol Pathol, 2013, 65(5):579-584.

[15] Guo H, Hu LM, Wang SX, et al. Neuroprotective effects of scutellarin against hypoxic-ischemic-induced cerebral injury via augmentation of antioxidant defense capacity. Chin J Physiol, 2011, 54(6):399-405.

ObjectiveTo study the effects of scutellarin on osteoblast differentiation in vitro.

MethodsCell model MC3T3-bmp2-Luc stably transfected with mouse bmp2 promoter-luciferase reporter vector was chosen to test the expression of the mouse bmp2 by scutellarin treatment. Then MC3T3-E1 cells and C3H10T1/2 cells were cultured in vitro to evaluate the effects of scutellarin on osteoblast differentiation. The osteogenic differentiation capacity was evaluated by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, alkaline phosphatase (ALP) assay (p-NPP methods), alizarin red staining and real-time PCR.

ResultsScutellarin was effective in up-regulating the transcription activity of bmp2 in the dose of 20 μmol/L (P < 0.001). The MTT assay showed that it neither promoted the proliferation nor induced cell death in the dose ranging between 1 - 20 μmol/L in MC3T3-E1 cells. Scutellarin could increase ALP activity in both MC3T3-E1 and C3H10T1/2 cell lines, especially in the dose of 10 and 20 μmol/L (P < 0.05). In the dose ranging between 5 - 10 μmol/L, the mineralization of C3H10T1/2 cells was enhanced by treatment with scutellarin. The mRNA synthesis of bmp2 was also promoted by scutellarin treatment for 12 days.

ConclusionScutellarin shows the effects on osteoblast differentiation, deserving further investigation as a potential anabolic agent. 【Key words】 Bone morphogenetic protein 2;Alkaline phosphatase;Osteogenic differentiation;Scutellarin

Author Affiliations: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (ZHAO Xiao-li, SI Shu-yi, WANG Zhen); University of Illinois at Urbana-Champaign, Department of Biochemistry, IL 61801, U S A (CHEN Jin-jing, CHEN Lin-feng)

www.cmbp.net.cn

Chin Med Biotechnol, 2016, 11(1):27-31

·論著·

[16] Li X, Wang L, Li Y, et al. Acute and subacute toxicological evaluation of scutellarin in rodents. Regul Toxicol Pharmacol, 2011, 60(1):106-111.

Effects of scutellarin on osteoblast differentiation

ZHAO Xiao-li, CHEN Jin-jing, SI Shu-yi, CHEN Lin-feng, WANG Zhen

【Abstract】

Corresponding Author:WANG Zhen, Email: wangzhen@imb.pumc.edu.cn

收稿日期：2015-12-08

通信作者：王真，Email：wangzhen@imb.pumc.edu

基金項目：國家自然科學(xué)基金海外及港澳學(xué)者合作研究基金（81328024）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.006