大腸埃希菌生物被膜形成能力測(cè)定及其耐藥性分析

易彩虹，劉德夢(mèng)（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300；天津醫(yī)院）

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大腸埃希菌生物被膜形成能力測(cè)定及其耐藥性分析

易彩虹1，劉德夢(mèng)2
（1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211；2天津醫(yī)院）

摘要：目的 建立大腸埃希菌生物被膜體外形成模型，觀察菌株的生物被膜形成能力及其耐藥性。方法 收集臨床標(biāo)本中分離的大腸埃希菌82株，采用平板培養(yǎng)法構(gòu)建細(xì)菌生物被膜的體外模型，用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物被膜形成能力，比較氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星對(duì)菌株的最低抑制濃度（MIC）和生物被膜抑制濃度（BIC）。結(jié)果 82株菌株均形成生物被膜，其中11株生物被膜形成能力為弱陽(yáng)性，68株為陽(yáng)性，4株為強(qiáng)陽(yáng)性。42株生物被膜形成能力為陽(yáng)性的菌株，對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為80．9%、45．2%、26．2%、35．7%、45．2%。形成生物被膜后，抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的BIC50、BIC90均大于相應(yīng)的MIC50、MIC90。結(jié)論 大部分臨床分離的大腸埃希菌有形成生物被膜的能力，形成生物被膜后菌株耐藥性增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；生物被膜；耐藥性；最低抑菌濃度；生物被膜抑制濃度

大腸埃希菌是常見(jiàn)的院內(nèi)感染細(xì)菌之一，附著于生物材料表面能形成生物被膜，抗菌藥物常規(guī)劑量通常無(wú)法滲透生物被膜，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)作［1，2］。相同條件下不同細(xì)菌形成的生物被膜的量不同，被膜越多對(duì)抗菌藥物的抗性越強(qiáng)［3］。如何有效突破細(xì)菌生物被膜的保護(hù)作用殺滅細(xì)菌，對(duì)于治療產(chǎn)生物被膜菌株引起的感染非常重要［4］。本研究通過(guò)構(gòu)建細(xì)菌生物被膜的體外模型，比較抗菌藥物氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度（MIC）和生物被膜抑制濃度（BIC），觀察生物被膜形成能力，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1　材料與方法

1．1菌株來(lái)源 選擇2014年3～11月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離的大腸埃希菌82株，其中分離自尿液20株、糞便62株。質(zhì)控菌株ATCC25922，為天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染研究所保存。所有菌株經(jīng)常規(guī)生化鑒定證實(shí)為大腸埃希菌。

1．2菌株生物被膜形成能力測(cè)定 采用結(jié)晶紫染色法［5］。隔夜培養(yǎng)大腸埃希菌菌液，調(diào)至0．5麥?zhǔn)媳葷岫龋?∶20比例稀釋后加入96孔板，空白對(duì)照孔只加培養(yǎng)液。35℃孵箱中培養(yǎng)24 h，生理鹽水沖洗。每孔加250 μL甲醇固定15 min，棄菌液風(fēng)干，加入150 μL結(jié)晶紫室溫下染色15 min，生理鹽水沖洗后風(fēng)干。每孔中加入250 μL 36%冰醋酸，10 min后測(cè)吸光度（OD）值，以上步驟重復(fù)3次取平均值。以陰性對(duì)照孔3次OD值平均值的標(biāo)準(zhǔn)差的3倍作為臨界值（ODC）。生物被膜形成能力的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：OD≤ODC為陰性，ODC＜OD≤2×ODC為弱陽(yáng)性，2×ODC＜OD≤4×ODC為陽(yáng)性，OD＞4×ODC為強(qiáng)陽(yáng)性。選擇生物被膜形成能力占主要地位的菌株用于MIC和BIC檢測(cè)。

1．3MIC檢測(cè) 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星5種抗菌藥物的MIC。方法參照CLSI （2014年）臨床微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)，并按照其標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。

1．4BIC檢測(cè)［6，7］將0．5麥?zhǔn)媳葷岫鹊拇竽c埃希菌菌液按1∶20比例稀釋后加入96孔板。將接種器插入細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，35℃培養(yǎng)24 h后取出，轉(zhuǎn)入96孔藥敏板中，35℃培養(yǎng)20 h后取出，轉(zhuǎn)入含100 μL LB肉湯的96孔板中，20 min內(nèi)在超聲震蕩儀中震蕩。然后放入35℃孵箱中培養(yǎng)6 h后取出，測(cè)量OD值。抗菌藥物的BIC為低于陽(yáng)性對(duì)照孔OD平均值10%的抗菌藥物濃度，依據(jù)CLSI（2014年）臨床微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2．1生物被膜形成能力檢測(cè)結(jié)果 82株菌株均有生物被膜形成，弱陽(yáng)性11株（13%），陽(yáng)性68株（82%），強(qiáng)陽(yáng)性4株（5%）。質(zhì)控菌株生物被膜形成能力為陽(yáng)性。

2．2MIC與BIC比較 從68株產(chǎn)生物被膜能力陽(yáng)性的大腸埃希菌中抽取42株進(jìn)行MIC和BIC測(cè)定。42株菌株對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為80．9%、45．2%、26．2%、35．7%、45．2%；其中多重耐藥17株，占40．4%。5種抗菌藥物對(duì)42株菌株的BIC50和BIC90均較MIC50和MIC90高。見(jiàn)表1。

表1　5種抗菌藥物對(duì)42株大腸埃希菌的MIC和BIC（μg／mL）

3　討論

通常情況下，大腸埃希菌屬于腸道正常菌群。當(dāng)機(jī)體免疫力低下、侵入性操作較多時(shí)，其可引起泌尿道、術(shù)后傷口等不同部位的感染。隨著抗菌藥物的濫用，其耐藥率愈來(lái)愈高［8］。既往研究顯示，大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率不斷提高［9］，大腸埃希菌耐藥情況嚴(yán)峻。

很多抗生素的臨床用藥指南是針對(duì)浮游微生物的，但是在環(huán)境中，包括大腸埃希菌在內(nèi)的大多數(shù)微生物是以集落或者生物被膜的形式存在的［10］。β-內(nèi)酰胺酶、外排泵和細(xì)菌耐藥片段的突變這三種耐藥機(jī)制均與生物被膜的存在有關(guān)。生物被膜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣含量可影響生物被膜中的細(xì)菌代謝，從而影響細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。而且在抗生素的持續(xù)作用下，大腸埃希菌能夠形成生物被膜以逃避機(jī)體的免疫清除，從而導(dǎo)致多種抗生素耐藥［11］。生物被膜既是細(xì)菌致病機(jī)制又是臨床治療失敗的原因之一［12］。相同條件下，不同細(xì)菌形成生物被膜的能力是不同的。細(xì)菌鞭毛和菌毛使得其易于黏附于固體表面（如導(dǎo)尿管、氣管插管等），增加了形成生物被膜的機(jī)會(huì)［13］。本研究中，82株菌株均形成了生物被膜，而大部分菌株產(chǎn)生生物被膜的能力中等。生物被膜既能夠阻止抗生素的穿入，又能限制細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)供給，使細(xì)菌生長(zhǎng)減慢，降低其對(duì)抗菌藥物的敏感性。形成生物被膜的量越大，對(duì)抗生素的抗性越強(qiáng)［14］。此外，生物被膜還可向周圍環(huán)境緩慢釋放浮游菌，成為潛在的感染源［15］，導(dǎo)致細(xì)菌感染難以治愈或反復(fù)發(fā)作。本研究對(duì)大腸埃希菌的BIC測(cè)定結(jié)果顯示，每種抗生素的BIC50和BIC90均高于相應(yīng)的MIC50和MIC90。表明形成生物被膜后細(xì)菌耐藥性大大增加。其中氨芐西林耐藥的菌株達(dá)100%，左氧氟沙星耐藥菌株菌株也超過(guò)65%。提示在大腸埃希菌感染形成生物被膜后，單獨(dú)應(yīng)用上述抗菌藥物可能使治療失敗，故臨床治療已形成生物被膜的大腸埃希菌感染應(yīng)謹(jǐn)慎選用這些抗菌藥物。

應(yīng)用能穿透生物被膜或抑制生物被膜形成的抗菌藥物治療產(chǎn)生物被膜菌株的感染至關(guān)重要。因此在未得到藥敏學(xué)結(jié)果之前，采用經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療時(shí)，對(duì)此類患者應(yīng)優(yōu)先考慮對(duì)產(chǎn)生物被膜細(xì)菌有效的抗菌藥物，以提高控制感染的效果。

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收稿日期：（2015-09-01）

中圖分類號(hào)：R978．1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X（2016）02-0062-02

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．026