瑞舒伐他汀對高脂血癥大鼠學習記憶能力的影響及機制

謝地成，孫金華，李維正，李海玲，劉同祥（濰坊醫學院，山東濰坊6000；濰坊市人民醫院）

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瑞舒伐他汀對高脂血癥大鼠學習記憶能力的影響及機制

謝地成1，孫金華2，李維正1，李海玲2，劉同祥2
（1濰坊醫學院，山東濰坊261000；2濰坊市人民醫院）

摘要：目的 觀察長期瑞舒伐他汀灌胃對高脂模型大鼠學習記憶能力及海馬顯微結構的影響。方法 將85只學習記憶能力正常的SD大鼠隨機分為正常對照組20只、模型組65只，模型組給予高脂飼料喂養，制作高脂血癥模型。造模成功后隨機分為模型對照組、高劑量組、常規劑量組，每組20只，分別經胃管給予生理鹽水、瑞舒伐他汀4 mg／kg、瑞舒伐他汀0．5 mg／kg，正常對照組給予等量生理鹽水，1次／d，連續5個月。觀察各組大鼠學習記憶能力，HE染色觀察各組大鼠海馬結構的變化，Western blot方法檢測海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白的表達。結果與對照組比較，模型對照組逃避潛伏期明顯延長，跨越次數明顯減少；海馬神經元細胞缺失、凋亡，神經元細胞結構不完整；海馬組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達增加（P均＜0．05）。高劑量組和常規劑量組逃避潛伏期較模型對照組縮短，跨越次數增加；海馬錐體細胞層增厚，海馬神經元排列整齊、緊密；海馬組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達降低（P均＜0．05），與正常對照組比較差異均無統計學意義（P均＞0．05）。結論 長期瑞舒伐他汀灌胃可提高高脂血癥大鼠的學習記憶能力，其機制可能與降低海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達，從而減少海馬神經元凋亡、保護海馬神經元結構的完整性有關。

關鍵詞：瑞舒伐他??；高脂血癥；學習記憶能力；海馬；Aβ1-42蛋白；Tau蛋白；大鼠

研究顯示，高脂血癥患者因血脂升高，易出現腦動脈粥樣硬化、腦血管意外等疾病，加重腦細胞損傷。腦內Aβ1-42含量增加和Tau蛋白過度磷酸化，在學習記憶能力損傷過程中起關鍵作用。他汀類藥物可顯著降低冠心病患者心血管事件的發生率和病死率［1～3］，是目前應用最廣泛的降脂藥物。美國食品藥品監督管理局不良反應自發呈報系統報道，他汀類藥物可能會導致高脂血癥患者認知能力降低，其機制可能與體內膽固醇濃度過度降低有關，膽固醇濃度過低可影響神經細胞代謝，進而引起神經細胞損傷。2014年11月～2015年4月，我們對高脂血癥模型大鼠給予他汀類藥物干預，觀察其學習記憶能力及海馬顯微結構的改變，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1．1材料 清潔級健康雄性SD大鼠90只，月齡2個月，體質量200～250 g，由濟寧魯抗醫學動物實驗中心提供。入組前行水迷宮檢測，選取認知能力正常的大鼠85只用于實驗。瑞舒伐他汀購于阿斯利康制藥有限公司。高脂飼料由1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉和79%基礎飼料組成［7］。

1．2動物分組及處理 將大鼠隨機分為正常對照組20只和模型組65只，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養45 d。第45天將模型組大鼠麻醉，經心臟取血測定TG、TC，以TG＞1．35 mmol／L、TC＞1．54 mmol／L為造模成功。將造模成功的60只大鼠隨機分為模型對照組、常規劑量組和高劑量組各20只，分別經胃管給予生理鹽水、瑞舒伐他汀0．5 mg／kg、瑞舒伐他汀4 mg／kg，正常對照組給予等量生理鹽水，1次／d，連續5個月。

1．3學習記憶能力檢測 末次給藥后進行Morris水迷宮檢測。將大鼠置于水迷宮4個象限行適應性訓練半天后，分別在4個象限進行定位航行試驗，測定大鼠2 min內找到平臺的時間，即逃避潛伏期。定位航行試驗結束后撤除平臺，行空間探索試驗，選擇相同入水點將大鼠分別放入水中，計數2 min內大鼠跨越原平臺象限的次數，連續檢測3 d取平均值。

1．4大鼠海馬結構觀察 采用HE染色。每組取10只大鼠用水合氯醛麻醉，經心臟灌注甲醛固定，取大腦組織用甲醛固定，逐級脫水、透明、浸蠟、包埋，切4 μm厚切片。脫蠟、逐級入水后，蘇木素染色2 min，加入鹽酸乙醇分化液分化數秒后，顯微鏡觀察細胞核的染色程度。氨水返藍，伊紅染色2 min，自來水沖洗3 min，逐級脫水、透明，中性樹膠封閉，蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察。

1．5大鼠海馬組織Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白檢測采用Western blot方法。每組取10只大鼠脫椎處死，立即取出大腦；低溫分離海馬組織，充分勻漿、裂解，離心取上清，分裝于0．5 mL離心管中，采用BCA法測定蛋白質濃度。取50 μL蛋白，加入6倍蛋白上樣緩沖液，加熱至煮沸。SDS-PAGE電泳，觀察目的蛋白凝膠條帶。80 V轉膜120 min，脫脂奶粉封閉1 h，依次加入一抗、二抗，TBST沖洗，ECL顯色，曝光顯影。應用KODAK1D軟件對各個條帶進行灰度值分析處理。用目的條帶與β-actin條帶的比值表示目的蛋白的表達強度。

2　結果

2．1各組水迷宮測驗結果 見表1。

表1　各組水迷宮測驗逃避潛伏期、跨越次數比較（珔x±s）

2．2各組海馬結構比較 與正常對照組比較，模型對照組大鼠海馬錐體細胞層變薄，細胞間隙增大，排列紊亂、疏松，有神經元細胞缺失、凋亡，神經元細胞結構不完整。高劑量組和常規劑量組海馬錐體細胞層增厚，神經元無明顯萎縮、核固縮、凋亡，與正常對照組比較亦未見明顯差異。

2．3各組海馬組織Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達比較 見表2。

表2　各組海馬組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達灰度值比較（珔x±s）

3　討論

海馬是與學習、記憶、行為和情緒密切相關的重要腦功能區，也是應激損傷和缺血損傷的主要靶器官。海馬神經元損傷是誘發認知能力和學習記憶能力下降的器質性基礎之一［8］。研究顯示，海馬組織Aβ1-42和Tau蛋白含量增加與認知能力降低呈正相關［6］。Aβ1-42激活膠質細胞誘發中樞神經系統炎性級聯反應、氧化應激產生自由基、胞內鈣穩態失衡，并誘導神經細胞凋亡，加重認知能力的降低［5］。Tau蛋白參與神經元軸突微管聚合、穩定和組裝，其主要功能是維持已形成微管的穩定性，并在微管延長過程中起到關鍵作用。研究表明，Tau蛋白過度磷酸化程度與認知損傷程度呈正相關。Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白引起神經元結構損傷，從而導致認知能力降低，腦內Aβ1-42含量增加和Tau蛋白過度磷酸化在導致大鼠認知和學習記憶能力降低過程中起關鍵作用，Aβ1-42可能通過CSK-3β誘導Tau蛋白過度磷酸化［9］，降低Tau蛋白結合微管的能力，Tau蛋白在神經元內聚積導致神經元軸突轉運障礙、乙酰膽堿釋放減少、蛋白酶體活性抑制、抗蛋白水解酶能力增強而具有神經毒性，這些功能和結構的改變可能導致神經元呈慢性進行性變性［10，11］。在腦神經細胞丟失并出現記憶和認知功能降低之前，已出現由Tau蛋白過度磷酸化導致的神經纖維纏結，是老年癡呆發病機制中的一個重要環節［12］。研究顯示，老年癡呆患者的Willis環和腦表面小血管的狹窄程度以及粥樣硬化斑塊較非癡呆人群更加顯著，腦小動脈硬化直接導致大腦能量和營養物質供應不足，引起神經元細胞損傷，腦內的局部炎癥反應加重神經元損傷［13］。

瑞舒伐他汀的藥理作用是抑制甲羥戊酸的合成，從而抑制Apo E分泌，降低中樞細胞外的Apo E水平，進而阻止神經纖維纏結［14］。趙水平等［15］報道，瑞舒伐他汀可通過減輕腦內的炎癥反應，保護神經元細胞，從而提高大鼠認知能力［15］。本研究顯示，與正常對照組比較，高脂血癥大鼠學習記憶能力降低，其原因可能與長期高血脂、腦動脈粥樣硬化、腦血管意外加重腦細胞損傷等因素有關。長期使用瑞舒伐他汀可增加高脂血癥大鼠海馬錐體細胞層厚度，減輕神經元細胞損傷，增加新生神經細胞再生，減少大鼠海馬組織內的海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋表達，縮短水迷宮測驗逃避潛伏期、增加跨越次數。高劑量組與常規劑量組比較無統計學差異，可能與瑞舒伐他汀降血脂功能強大且安全有效，常規劑量和高劑量均能很好降低血脂濃度有關。

綜上所述，長期使用瑞舒伐他汀可提高高脂血癥大鼠的學習記憶能力，其機制可能與降低海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達，從而減少海馬神經元凋亡、保護海馬神經元結構的完整性有關。

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·作者·編者·讀者·

收稿日期：（2015-09-22）

通信作者：劉同祥（E-mail：Liutxi＠126．com）

中圖分類號：R972

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0028-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．010