NF-κB寡核苷酸誘騙劑誘導(dǎo)的大鼠耐受型樹突狀細(xì)胞及其免疫學(xué)特性觀察

蹇孝麗，尹向飛，岳萍，胡恒貴，蔣紅梅（貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004；廈門市第二人民醫(yī)院；蚌埠醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院）

?

NF-κB寡核苷酸誘騙劑誘導(dǎo)的大鼠耐受型樹突狀細(xì)胞及其免疫學(xué)特性觀察

蹇孝麗1，尹向飛2，岳萍1，胡恒貴3，蔣紅梅1
（1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004；2廈門市第二人民醫(yī)院；3蚌埠醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院）

摘要：目的 用核因子κB（NF-κB）寡核苷酸誘騙劑（ODN Decoy）誘導(dǎo)大鼠耐受型樹突狀細(xì)胞（DC）并負(fù)載牛Ⅱ型膠原（BⅡC），評(píng)價(jià)其免疫學(xué)特性。方法 用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)SD大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分化成DC，將其分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)1、2組，均繼續(xù)加入GM-CSF、IL-4，同時(shí)實(shí)驗(yàn)1、2組加入ODN Decoy，培養(yǎng)7 d實(shí)驗(yàn)2組加入BⅡC。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86，同種異體淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞增殖情況及其對(duì)BⅡC和人血清刺激的反應(yīng)，檢測(cè)上清液中Th1／Th2細(xì)胞因子IFN-γ／IL-10。結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)1、2組CD80、CD86表達(dá)均降低（P均＜0．05）；實(shí)驗(yàn)1組淋巴細(xì)胞增殖程度及IFN-γ明顯降低（P均＜0．05），IL-10無明顯變化；實(shí)驗(yàn)2組加入BⅡC后淋巴細(xì)胞增殖程度及IFN-γ、IL-10均無明顯變化（P均＞0．05）。實(shí)驗(yàn)2組中，與加入BⅡC相比，加入健康人血清后淋巴細(xì)胞明顯增殖（P＜0．05），IFN-γ升高，IL-10降低（P均＜0．05）。結(jié)論 用NF-κB ODN Decoy成功誘導(dǎo)獲得耐受型DC。該DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較低，且抑制淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)向Th1方向偏移；負(fù)載BⅡC后刺激的淋巴細(xì)胞對(duì)該抗原特異性耐受，而對(duì)無關(guān)抗原的免疫應(yīng)答無明顯影響。

關(guān)鍵詞：樹突狀細(xì)胞；核因子κB；寡核苷酸；誘騙劑；Ⅱ型膠原；免疫耐受；大鼠

樹突狀細(xì)胞（DC）是重要的抗原遞呈細(xì)胞，在免疫反應(yīng)的激活和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，影響免疫耐受和免疫反應(yīng)之間的平衡。未成熟DC由于低表達(dá)協(xié)同刺激分子（CD80、CD86、CD40等），激活初始T細(xì)胞的能力很弱，導(dǎo)致T細(xì)胞的“無能”或低反應(yīng)，從而誘導(dǎo)抗原特異性耐受［1，2］。利用未成熟DC誘導(dǎo)免疫耐受，可以阻止自身免疫反應(yīng)，用于器官移植排斥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病及慢性炎癥的治療［3］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是常見的自身免疫性疾病。Ⅱ型膠原（ⅡC）是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，是與RA密切相關(guān)的自身抗原。核因子κB（NF-κB）在DC成熟信號(hào)傳導(dǎo)通路中起決定性作用［4，5］，其寡核苷酸誘騙劑（ODN Decoy）可阻斷轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，抑制DC表型和DC成熟，從而獲得耐受型DC［6］。2012～2014年，我們采用與NF-κB特異性結(jié)合位點(diǎn)（靶基因啟動(dòng)區(qū)）一致的ODN Decoy處理大鼠DC獲得耐受型DC，并使其負(fù)載牛Ⅱ型膠原（BⅡC），評(píng)價(jià)其免疫學(xué)特性，為獲得治療RA的抗原特異性耐受型DC疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料 清潔級(jí)雌性SD大鼠和雄性Wistar大鼠，7～8月齡，體質(zhì)量250～320 g。大鼠NF-κB ODN Decoy由上海生工生物工程公司合成［7］。

1．2DC的分離與培養(yǎng) 取雌性SD大鼠脾臟制成細(xì)胞懸液，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于6孔板。待單核細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)液，用含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至2．5 mL，加入GM-CSF 30 ng／mL、IL-4 20 ng／mL（Peprotech公司）誘導(dǎo)DC擴(kuò)增。培養(yǎng)第3天每孔再加完全RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，并補(bǔ)充GM-CSF至30 ng／mL、IL-4至20 ng／mL；第6天離心棄1．5 mL上清液，再補(bǔ)足相應(yīng)新鮮培養(yǎng)液和GM-CSF、IL-4；第8天收獲細(xì)胞行臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和活力＞92%。用PE-OX-62抗體行單細(xì)胞染色檢測(cè)DC特異性標(biāo)志OX-62，其表達(dá)率＞70%，說明獲得了純度較高的DC。

1．3細(xì)胞分組與耐受型DC的構(gòu)建 將DC細(xì)胞分為3組，均加入終濃度30 ng／mL的GM-CSF、20 ng／mL的IL-4，同時(shí)實(shí)驗(yàn)1、2組加入終濃度為5 μmol／L 的ODN Decoy，培養(yǎng)7 d實(shí)驗(yàn)2組再加入終濃度50 mg／L的BⅡC（Sigma公司）。第8天收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．4免疫表型CD80和CD86檢測(cè) 將各組細(xì)胞用PBS重懸為單細(xì)胞懸液，加入PE-CD80抗體和FITC-CD86抗體行單細(xì)胞雙標(biāo)染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示CD80和CD86的表達(dá)強(qiáng)度。

1．5免疫活性觀察 采用體外同種異體淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)。將上述3組細(xì)胞加入絲裂霉素C，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度為2×105／mL，作為刺激細(xì)胞；取雄性Wistar大鼠脾臟，研磨，制成細(xì)胞懸液，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整密度為1×106／mL，作為反應(yīng)細(xì)胞。取對(duì)照組細(xì)胞100 μL，加入反應(yīng)細(xì)胞100 μL；實(shí)驗(yàn)1組細(xì)胞100 μL，加入反應(yīng)細(xì)胞100 μL；取實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞100 μL分成兩管各50 μL，均加入對(duì)照組細(xì)胞50 μL和反應(yīng)細(xì)胞100 μL，然后分別加入BⅡC（終濃度2 μg／mL）和健康人血清20 μL（56℃、30 min滅活）。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，置5% CO2培養(yǎng)箱、37℃培養(yǎng)68 h，取上清液檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10。加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入二甲亞砜振蕩混勻，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖的OD值。

2　結(jié)果

2．1各組D80、CD86表達(dá)強(qiáng)度比較 見表1。

表1　各組CD80、CD86表達(dá)強(qiáng)度比較（珔x±s）

2．2各組細(xì)胞增殖情況比較 對(duì)照組OD值為0．346±0．056，實(shí)驗(yàn)1組為0．279±0．034，實(shí)驗(yàn)2組加入BⅡC和人血清后的OD值分別為0．438± 0．092、0．712±0．073。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)1組刺激淋巴細(xì)胞增殖程度顯著降低（P＜0．05）。與實(shí)驗(yàn)2組加BⅡC比較，實(shí)驗(yàn)2組加人血清后淋巴細(xì)胞增殖程度顯著升高（P＜0．01）。

2．3各組細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-10水平比較見表2。

表2　各組細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-10水平比較（ng／L，珔x±s）

3　討論

DC能夠刺激初始型T細(xì)胞增殖，是機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)的啟動(dòng)者，在調(diào)節(jié)免疫激活和免疫耐受的平衡過程中起重要作用［8］。DC的這種能力與其成熟狀態(tài)有關(guān)，只有未成熟的DC才具有耐受原性［9，10］。NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其活化對(duì)DC激活T細(xì)胞起關(guān)鍵作用［11］。本研究采用ODN Decoy處理大鼠脾臟來源的DC，結(jié)果顯示，處理后的DC其CD80表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，而CD86幾乎不表達(dá)，是一種相對(duì)不成熟的DC表型特征。

T細(xì)胞活化后可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。IFN-γ是主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，而IL-10是由Th2產(chǎn)生的強(qiáng)力的抑制性因子，可下調(diào)促炎性因子表達(dá)，發(fā)揮免疫耐受作用。T細(xì)胞活化需要抗原遞呈細(xì)胞提供信號(hào)，未成熟DC由于缺乏激活T細(xì)胞的第二信號(hào)，導(dǎo)致T細(xì)胞無能或低反應(yīng)，從而誘導(dǎo)免疫耐受［12］。本研究顯示，耐受型DC刺激混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力顯著低于對(duì)照組，并且其明顯抑制活化T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，但不影響IL-10分泌，表明耐受型DC能抑制T細(xì)胞向Th1方向偏離。與以往文獻(xiàn)［13］報(bào)道相似。本研究在DC培養(yǎng)體系中加入NF-κB ODN Decoy后，又加入BⅡC，使其對(duì)BⅡC完成攝取和表達(dá)過程，制備負(fù)載BⅡC的耐受型DC。結(jié)果顯示，負(fù)載BⅡC后細(xì)胞表面CD80和CD86的表達(dá)仍然保持與耐受型DC相似的低表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)，在體外將BⅡC和人血清蛋白分別加入負(fù)載BⅡC的耐受型DC、成熟DC和同種異體淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中，結(jié)果顯示，淋巴細(xì)胞受到人血清蛋白的刺激而顯著增殖，且高分泌IFN-γ，低分泌IL-10，免疫平衡向Th1方向偏移，呈現(xiàn)免疫活化狀態(tài)；而對(duì)BⅡC的刺激則表現(xiàn)為增殖抑制，且低分泌IFN-γ，高分泌IL-10，免疫平衡向Th2方向偏移，呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)。負(fù)載BⅡC的耐受型DC由于相對(duì)低地表達(dá)CD80和CD86等共刺激分子，不能充分提供BⅡC特異性淋巴細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)，而僅能提供BⅡC特異性抗原刺激的第一信號(hào)，致使淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為針對(duì)BⅡC的特異性無能或低反應(yīng)性；而對(duì)人血清蛋白，負(fù)載BⅡC的耐受型DC不能傳達(dá)特異性抑制信號(hào)，而通過成熟DC刺激T細(xì)胞活化，表現(xiàn)出明顯的增殖反應(yīng)。這種負(fù)載了特異性抗原的耐受型DC可能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞針對(duì)該抗原的特異性耐受，卻并不干擾淋巴細(xì)胞針對(duì)其他抗原的應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，用NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)的耐受型DC表現(xiàn)了較低的體外刺激混合淋巴細(xì)胞的能力，將其負(fù)載抗原后表現(xiàn)為相對(duì)特異性的致免疫耐受作用。提示應(yīng)用Decoy技術(shù)可望獲得耐受型DC疫苗，為RA的治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

［1］Kornete M，Piccirillo CA．Functional crosstalk between dendritic cells and Foxp3（＋）regulatory T cells in the maintenance of immune tolerance［J］．Front Immunol，2012，22（3）：165．

［2］Thomson AW．Tolerogenic dendritic cells：all present and correct ［J］．Am J Transplant，2010，10（2）：214-219．

［3］Matsue H，Yang C，Matsue K，et al．Contrasting impacts of immunosuppressive agents（rapamycin，F(xiàn)K506，cyclosporine A，and dexamethasone）on bidirectional dendritic cell-T cell interaction during antigen presentation［J］．Immunol，2002，169（7）：3555-3564．

［4］Xu DL，Liu Y，Tan JM，et al．Marked prolongation of murine cardiac allograft survival using recipient immature dendritic cells loaded with donor-derived apoptotic cells［J］．Scand J Immunol，2004，59（6）：536-544．

［5］Zhu R，Zhu Y，Zhang M，et al．The induction of maturation on dendritic cells by TiO2and Fe3O4TiO2nanoparticles via NF-κB signaling pathway［J］．Mater Sci Enq C Mater Biol Appl，2014，1 （39）：305-324．

［6］徐東亮，唐孝達(dá)，李博，等．核因子-κB對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞分化成熟及其體外刺激T細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響［J］．中華器官移植雜志，2004，3（25）：89-92．

［7］Bonham CA，Peng L，Liang X，et al．Marked prolongation of cardiac allograft survival by dendritic cells genetically engineered with NF-kappa B oligodeoxyribonucleotide decoys and adenoviral vectors encoding CTLA4-Ig［J］．Immunol，2002，169（6）：3382-3391．

［8］Ma Y，Shurin GV，Peiyuan Z，et al．Dendritic cells in the cancer microenvironment［J］．Cancer，2013，4（1）：36-44．

［9］Steinman RM，Idoyaga J．Features of the dendritic cell lineage ［J］．Immunol Rev，2010，234（1）：5-17．

［10］Orange DE，Blachere NE，F(xiàn)ak J，et al．Dendritic cells loaded with FK506 kill T cells in an antigen-specific manner and prevent autoimmunity in vivo［J］．Elife，2013（2）：e00105．

［11］Ouaaz F，Arron J，Zheng Y，et al．Dendritic cell development and survival require distinct NF-κappa B subnuits［J］．Immunity，2002，16（2）：257-270．

［12］Xie J，Lin YK，Wang K，et al．Induced immune tolerance of autoantigen loade dimmature dendritic cells in homogenic lupus mice ［J］．Genet Mol Res，2014，13（1）：1251-1262．

［13］Ouaaz F，Arron J，Zheng Y，et al．Dendritic cell development and survival require distinct NF-κappaB subunits［J］．Immunity，2002，16（2）：257-270．-

Immunological characters of rat tolerogenic dendritic cells induced by NF-κB oligodeoxynucleotide decoy

JIAN Xiaoli1，YIN Xiangfei，Yue Ping，HU Henggui，JIANG Hongmei
（1 Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

Abstract：Objective To evaluate the immunological characters of rat tolerogenic dendritic cells（DCs）induced by nuclear factor κB oligonucleotides decoy（NF-κB ODN decoy）and loaded with bovine collageb typeⅡ（BⅡC）in vitro．Methods The rat spleen monocytes were induced by recombinant GM-CSF and IL-4 in vitro to differentiate into DCs．Those DCs were divided into three groups：the control group which was added with cytokines，experimental group 1 which was dealt with NF-κB ODN decoy，and the experimental group 2 which was dealt with NF-κB ODN decoy and followed by BⅡC after being cultured for 7 days．The expression of CD80 and CD86 was analyzed by using flow cytometry．Allogeneic lymphocyte stimulation test was used to evaluate the lymphocyte proliferation and the reaction for BⅡC and human serum stimulation．Meanwhile，the concentration of IL-10 and IFN-γ in supernatant was detected．Results Compared with the control group，the CD80 and CD86 expression intensities in the experimental groups 1 and 2 were decreased（all P＜0．05）；the lymphocyte proliferation and expression of IFN-γ was significantly decreased in the experimental group 1（all P＜0．05），but the IL-10 showed no significant difference．In the experimental group 2，after adding BⅡC，lymphocyte proliferation and expression of IFN-γ and IL-10 showed no significant difference （all P＞0．05）．However，after adding healthy human serum，the lymphocyte proliferation and expression of IFN-γ was significantly increased，and the expression of IL-10 was decreased in the experimental group 2（all P＜0．05）．Conclusions NF-κB ODN decoy successfully induced to construct rats′tolerogenic DCs．The tolerogenic DC exhibited low capability to stimulate lymphocytes and inhibited the lymphocyte immune response to Th1 shift direction．When loaded with BⅡC，the lymphocytes that stimulated by BⅡC exhibited specific tolerance against the specific antigens but had no significant effect on the antigen-independent immune response．

Key words：dendritic cells；nuclear factor-κB；oligonucleotides；decoy；Ⅱcollagen；immune tolerance；rats

收稿日期：（2015-09-29）

通信作者簡(jiǎn)介：蔣紅梅（1973-），女，碩士研究生導(dǎo)師，教授，主要研究方向?yàn)樽陨砻庖咝约膊　-mail：646117948＠qq．com

作者簡(jiǎn)介：第一蹇孝麗（1990-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樽陨砻庖咝约膊　-mail：993249570＠qq．com

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳貴陽醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LG字［2012］004號(hào)）。

中圖分類號(hào)：R329．2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X（2016）02-0017-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．006