SETD2 mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與LMP1的關(guān)系

趙利剛，林中原，覃靈燕，李音音，莫武寧，楊崢（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021）

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SETD2 mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與LMP1的關(guān)系

趙利剛，林中原，覃靈燕，李音音，莫武寧，楊崢
（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021）

摘要：目的 檢測鼻咽癌組織和鼻咽癌細(xì)胞株中人源含SET結(jié)構(gòu)域蛋白2（SETD2）mRNA的表達(dá)，并分析其與EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1（LMP1）的關(guān)系。方法 取42例初診鼻咽癌患者（觀察組）和15例慢性鼻咽黏膜炎癥患者（對照組）的手術(shù)活檢組織標(biāo)本，另取人高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LMP1基因的CNE1細(xì)胞株CNE1-LMP1，采用實時熒光相對定量PCR方法檢測觀察組、對照組鼻咽組織以及CNE1-LMP1與CNE1中的SETD2 mRNA。結(jié)果 觀察組SETD2 mRNA相對表達(dá)量為1．596±0．916，低于對照組的2．194±1．144，且隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級升高而降低（P均＜0．05）；CNE1-LMP1中SETD2 mRNA相對表達(dá)量為0．676±0．042，低于CNE1的0．870±0．114（P＜0．05）。結(jié)論 SETD2在鼻咽癌組織中的表達(dá)下調(diào)，可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，SETD2基因表達(dá)下調(diào)可能與EB病毒編碼的LMP1有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；人源含SET結(jié)構(gòu)域蛋白2；潛伏膜蛋白1

鼻咽癌是一種極具地域性的腫瘤，我國鼻咽癌發(fā)病率和病死率均居世界首位，嚴(yán)重影響人們的生存質(zhì)量［1］。鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，與遺傳易感性、EB病毒感染及環(huán)境因素緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，人源含SET結(jié)構(gòu)域蛋白2 （SETD2）是一個腫瘤抑制因子［2］，參與轉(zhuǎn)錄延伸和DNA同源重組修復(fù)［3，4］。該基因在乳腺癌［5］、腎癌［6］、白血病［2］中表達(dá)異常，但在鼻咽癌中的研究較少。EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1（LMP1）對促進(jìn)癌癥發(fā)生、發(fā)展和誘導(dǎo)相關(guān)抑癌基因失活具有重要作用［7］。2014年11～12月，我們檢測了鼻咽癌組織中以及人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和轉(zhuǎn)染LMP1的細(xì)胞株CNE1-LMP1中SETD2 mRNA的表達(dá)，分析其與LMP1基因的關(guān)系。

1　材料與方法

1．1材料 收集我院2011年2月～2014年10月收治的初診鼻咽癌患者42例（觀察組），男31例、女11例，年齡23～74歲、中位年齡47．5歲；慢性鼻咽黏膜炎癥患者15例（對照組），男12例、女3例，年齡20～59歲、中位年齡41歲。均經(jīng)病理學(xué)檢查證實。取兩組活檢組織標(biāo)本，－80℃保存。人高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE1來自廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉實驗室，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LMP1基因的CNE1細(xì)胞株CNE1-LMP1購自湖南中南大學(xué)湘雅實驗中心，細(xì)胞均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2SETD2 mRNA檢測 采用實時熒光相對定量PCR方法。使用TRIzol試劑提取鼻咽組織及細(xì)胞株CNE1-LMP1、CNE1的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，－20℃保存。內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，產(chǎn)物長度138 bp。目的基因SETD2由上海英濰捷基公司合成，上游引物序列5′-TCCAACAGTCTATGGTGTGA-3′，下游引物序列5′-TGAGCTGTGAAAATCTGTTG-3′，產(chǎn)物長度114 bp。ABI7300定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：20 μL（SYBR GreenⅠ核酸染料10 μL，ROX 0．4 μL，上、下游引物各0．8 μL，模板cDNA 2 μL，以及去離子水6 μL）。PCR循環(huán)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，共40個循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗證目的條帶大小，確定PCR產(chǎn)物的特異性。采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，ΔΔCt＝實驗組（Ct目的基因－CtGAPDH）－對照組（Ct目的基因－CtGAPDH）。重復(fù)檢測3次取平均值。

1．3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1各組SETD2 mRNA表達(dá)比較 觀察組和對照組的SETD2 mRNA相對表達(dá)量分別為1．596± 0．916、2．194±1．144，兩組比較P＜0．05。CNE1-LMP1與CNE1的SETD2 mRNA相對表達(dá)量分別為0．676±0．042、0．870±0．114，兩者比較P＜0．05。

2．2SETD2 mRNA表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

3　討論

鼻咽癌發(fā)生部位較隱蔽，且早期癥狀不典型，患者確診時多已至中晚期，失去最佳治療時機(jī)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。尋找鼻咽癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記物對鼻咽癌的治療具有重要意義。癌癥發(fā)生的分子機(jī)制包括癌基因的激活和抑瘤基因的失活［8］。抑癌基因SETD2位于染色體3p21．3位點，蛋白大小為230 kD，屬于含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，可特異性催化組蛋白H3K36位點三甲基化修飾，SETD2功能破壞可導(dǎo)致H3K36me3功能丟失［9］。SETD2-H3K36me3通路的功能破壞是白血病發(fā)生、發(fā)展的表觀遺傳機(jī)制［2］。組蛋白甲基化在真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用，SETD2基因蛋白包含轉(zhuǎn)錄激活域，與高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ有關(guān)，影響基因表達(dá)的調(diào)控。另外，SETD2還參與基因的同源重組修復(fù)［10］。SETD2主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，胞質(zhì)中也有少量分布［11］。SETD2基因在乳腺癌、腎癌、白血病等惡性腫瘤中存在表達(dá)降低或缺失，且在腎透明細(xì)胞癌中，該基因突變與癌癥進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)［12］，說明SETD2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。研究表明，SETD2對p53參與的細(xì)胞凋亡過程具有明顯的促進(jìn)作用，可增強(qiáng)大多數(shù)p53下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，是p53正向調(diào)控因子［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中SETD2 mRNA表達(dá)較鼻咽部炎癥組織明顯降低，且隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級升高而降低。提示SETD2 mRNA表達(dá)降低在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能是一個早期事件，隨著癌癥進(jìn)一步發(fā)展，其表達(dá)進(jìn)一步下降。由此推測，SETD2 mRNA表達(dá)降低與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，SETD2可能作為鼻咽癌潛在的分子生物學(xué)標(biāo)記物。

表1　SETD2　mRNA表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系（珔x±s）

EB病毒是人類發(fā)現(xiàn)的第一種與腫瘤密切相關(guān)的病毒，與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和一部分胃癌等均有關(guān)，尤其在鼻咽癌中的檢出率極高，是鼻咽癌三大病因之一［14］。鼻咽癌患者的死亡原因主要是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，而EB病毒編碼的致瘤蛋白LMP1可促使癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，且能誘導(dǎo)相關(guān)抑癌基因失活，對促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展起重要作用［7］。故研究抑癌基因SETD2與LMP1的關(guān)系并探討其作用機(jī)制，對闡明鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CNE1-LMP1中的SETD2 mRNA表達(dá)低于CNE1，表明鼻咽癌細(xì)胞中SETD2表達(dá)降低與LMP1有關(guān)，LMP1可能通過某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對其進(jìn)行靶向調(diào)控或者誘導(dǎo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)［15，16］，引起SETD2基因表達(dá)水平的改變，因LMP1可促使p53蛋白的泛素化和降解［17］，SETD2又可與p53免疫共沉淀［5］，故LMP1也可能以促進(jìn)泛素化和蛋白酶降解的方式作用于SETD2基因，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

EB病毒感染普遍被認(rèn)為是鼻咽癌主要病因之一。在本研究中EB病毒致瘤蛋白LMP1可下調(diào)抑癌基因SETD2的表達(dá)，而SETD2與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。綜上所述，SETD2可能成為鼻咽癌早期診斷的新的分子生物學(xué)標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)：

［1］Jia WH，Qin HD．Non-viral environmental risk factors for nasopharyngeal carcinoma：a systematic review［J］．Semin Cancer Biol，2012，22（2）：117-126．

［2］Zhu X，He F，Zeng H，et al．Identification of functional cooperative mutations of SETD2 in human acute leukemia［J］．Nat Genet，2014，46（3）：287-293．

［3］Newbold RF，Mokbel K．Evidence for a tumour suppressor function of SETD2 in human breast cancer：a new hypothesis［J］．Anticancer Res，2010，30（9）：3309-3311．

［4］Pfister SX，Ahrabi S，Zalmas LP，et al．SETD2-dependent histone H3K36 trimethylation is required for homologous recombination repair and genome stability［J］．Cell Rep，2014，7（6）：2006-2018．

［5］Al Sarakbi W，Sasi W，Jiang WG，et al．The mRNA expression of SETD2 in human breast cancer：correlation with clinico-pathological parameters［J］．BMC Cancer，2009（9）：290．

［6］Dalgliesh GL，F(xiàn)urge K，Greenman C，et al．Systematic sequencing of renal carcinoma reveals inactivation of histone modifying genes［J］．Nature，2010，463（7279）：360-363．

［7］Yoshizaki T，Kondo S，Wakisaka N，et al．Pathogenic role of Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 in the development of nasopharyngeal carcinoma［J］．Cancer Lett，2013，337（1）：1-7．

［8］程紅蕾，王若雨．鼻咽癌相關(guān)基因研究進(jìn)展［J］．國際腫瘤學(xué)雜志，2013，40（9）：662-665．

［9］Braga E，Senchenko V，Bazov I，et al．Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3P in major human epithelial malignancies：allelotyping and quantitative real-time PCR［J］．Int J Cancer，2002，100（5）：534-541．

［10］Wang Q，Cheng T．Evidences for mutations in the histone modifying gene SETD2 as critical drivers in leukemia development［J］．Sci China Life Sci，2014，57（9）：944-946．

［11］謝萍，田春艷，張令強(qiáng)，等．組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2對P53介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)控［J］．軍事醫(yī)學(xué)，2011，35（1）：30-34．

［12］Hakimi AA，Ostrovnaya I，Reva B，et al．Adverse outcomes in clear cell renal cell carcinoma with mutations of 3p21 epigenetic regulators BAP1 and SETD2：a report by MSKCC and the KIRC TCGA research network［J］．Clin Cancer Res，2013，19（12）：3259-3267．

［13］Xie P，Tian C，An L，et al．Histone methyltransferase protein SETD2 interacts with p53 and selectively regulates its downstream genes［J］．Cell Signal，2008，20（9）：1671-1678．

［14］Tsao SW，Yip YL，Tsang CM，et al．Etiological factors of nasopharyngeal carcinoma［J］．Oral Oncol，2014，50（5）：330-338．

［15］Tsai CN，Tsai CL，Tse KP，et al．The Epstein-Barr virus oncogene product，latent membrane protein 1，induces the downregulation of E-cadherin gene expression via activation of DNA methyltransferases［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（15）：10084-10089．

［16］Man C，Rosa J，Lee LT，et al．Latent membrane protein 1 suppresses RASSF1A expression，disrupts microtubule structures and induces chromosomal aberrations in human epithelial cells［J］．Oncogene，2007，26（21）：3069-3080．

［17］Husaini R，Ahmad M，Soo-Beng Khoo A．Epstein-Barr virus Latent Membrane Protein LMP1 reduces p53 protein levels independent of the PI3K-Akt pathway［J］．BMC Res Notes，2011（4）：551．

·基礎(chǔ)研究·

Expression of SETD2 mRNA in nasopharyngeal carcinoma and its relationship with LMP1

ZHAO Ligang，LIN Zhongyuan，QIN Lingyan，LI Yinyin，MO Wuning，YANG Zheng
（The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Abstract：Objective To detect the SETD2 mRNA expression in the nasopharyngeal carcinoma（NPC）tissues and NPC cell line，and to explore its relationships with latent membrane protein 1（LMP1）coded by EB virus．Methods Real-time fluorescent relatively quantitative PCR was used to detected SETD2 mRNA expression in 42 nasopharyngeal carcinoma tissues（observation group），15 non-cancerous nasopharyngeal tissues（control group），and high-differentiated nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE1 and CNE1-LMP1．Results The SETD2 mRNA expression of the observation group （1．596±0．916）was lower than that of the control group（2．194±1．144）（P＜0．05），and decreased with the increased lymph node metastasis grading．The SETD2 mRNA expression of CNE1-LMP1（0．676±0．042）was lower than that of CNE1（0．870±0．114）（P＜0．05）．Conclusions The declined expression of SETD2 mRNA indicated that it might be involved in the development and progression of nasopharyngeal carcinoma．The down-regulation of SETD2 gene was related with EBV-LMP1 to some degree．

Key words：nasopharyngeal carcinoma；SETD2；latent membrane protein 1

收稿日期：（2015-09-30）

通信作者簡介：楊崢（1985-），男，主管技師。主要研究方向為鼻咽癌、白血病的發(fā)病機(jī)制。E-mail：jackyyoung＠foxmail．com

作者簡介：第一趙利剛（1988-），男，在讀碩士生。主要研究方向為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制。E-mail：zhlg0771＠163．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81460414）。

中圖分類號：R739．6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0020-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．007