魚類腸道微生物研究進展

翟萬營，郭安寧

（1上海海洋大學，省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2上海海洋大學，水產與生命學院，上海 201306）

魚類腸道微生物研究進展

翟萬營1,2，郭安寧1,2

（1上海海洋大學，省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2上海海洋大學，水產與生命學院，上海 201306）

腸道微生物種類和含量豐富，對機體生長發育具有重要影響。魚類作為脊椎動物的重要組成部分，其生活在水體環境中，腸道微生物容易受到食物、壓力、宿主生長發育、環境等影響，同時對機體的營養、生長、和免疫等都有重要作用。本文綜述近年來國內外對魚類腸道微生物的研究進展，闡述魚類腸道菌群的影響因素、腸道微生物對機體營養代謝、免疫調節等的影響，以期為魚類等水生動物的生態健康養殖提供理論支撐，推動水產養殖業的可持續發展。

魚類；腸道微生物；核心菌群；宿主

腸道微生物在動物體內數量龐大，結構復雜，與宿主相互依賴、相互制約，經過長期進化，與宿主腸道形成了一個特定的腸道微生態系統，有相當一部分微生物長期定居在動物腸道中，具有營養、防御和免疫調節等生理功能，并且對機體的生長發育具有重要影響[1]。

正常人體腸道微生物數量有近1014個，超過人體自身細胞的10倍以上，對營養物質代謝、機體自身發育、免疫及疾病的產生等方面都起到極其重要的作用，而且很多研究結果都表明腸道微生物和多種疾病發病直接相關，如癌癥、肥胖、神經變性疾病等。

脊椎動物的腸道微生物種群構成受飲食、營養狀態和發育階段、健康情況的影響。魚類作為水生動物的重要組成部分，占將近一半的脊椎動物物種，由于腸道微生物與所處的腸道環境及魚體生活的水體環境緊密相關，與陸生脊椎動物相比，因其處在更為復雜的生態環境之中，更容易受到食物供給、環境變化（如溫度、鹽度）、壓力等的影響，且魚的種類、遺傳背景、生長發育和性別都會對腸道微生物產生一定影響，因此其腸道微生物結構和陸生動物相比具有更大的多樣性和復雜性[2,3]，這給研究魚類腸道微生物帶來了很大的挑戰。盡管如此，國內外學者通過對魚類腸道微生物的初步研究，取得了較好的進展。

1 魚類腸道微生物組成

魚類腸道可能是微生物最密集的微生態系統，但是基于二代測序技術和生物信息學分析，研究者發現其生物多樣性相對較低，主要有變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌（Actinobacteria）、梭狀芽胞桿菌（Clostridia）、桿菌（Bacilli）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門在不同的魚類中都幾乎占90%以上。這些微生物在不同魚類中都有相似發現，表明變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門對宿主腸道功能有重要影響和作用。因此，Roeseiers等提出了“核心菌群”（core gut microbiota）的概念，盡管這個概念最初用于哺乳動物，但是學者發現“核心菌群”同樣適用于硬骨魚類，“核心菌群”可以有效調控腸道微生物結構組成，促進魚類健康生長。

2 影響腸道微生物的因素

2.1 食物對于腸道菌群的影響

食物（食性）在很大程度上影響腸道菌群結構。Carmody等[4]對五種不同的近交系小鼠和超過200只遠交群小鼠以及轉基因小鼠研究觀察，發現相比于宿主基因型，食物（飲食）對個體腸道菌群改變起到更為重要作用。Romero等認為食物和水環境對幼魚階段腸道微生物的定植起到重要的作用，并最終決定了成魚腸道內相對穩定的菌群結構。李可俊等[5]在對長江口8種野生魚類的腸道菌群的比較中，發現魚類腸道菌群多樣性的差異與魚類的食性相關，且食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。

早在上世紀90年代，有研究者對6種魚包括腸道等組織的微生物類群和數量進行觀察發現，發現腐屑食性魚類（detritivorous fish）比濾食性魚類（filter-feeding fish）的微生物種類多，且腸道內的微生物種類和數量多于其他組織。浮游生物食性魚類（planktivorous fish）腸道微生物種類最多，其次是雜食性魚類（omnivorous fish）和草食性魚類（herbivorous fish），微生物種類最少的是肉食性魚類（carnivorous fish）[6]。

同一種魚攝食不同食物后，其消化道微生物群落結構也會發生改變。Apper等用小麥水解蛋白作為部分食物飼喂亞洲鱸魚（Lates calcarifer），發現其腸粘膜上微生物鏈球菌（Streptococcussp.）、魏斯菌（Weissella confusa，Weissellasp.）、不動桿菌（Acinetobactersp.）、棒桿菌（Corynebacteriumsp.）、明串珠菌（Leuconostocsp.）、葡萄球菌（Staphylococcus epidermis）和金黃桿菌（Chryseobacteriumsp.）的豐度顯著高于用魚粉或僅用動植物蛋白喂養的魚，同時提高了喂養效率，并且發現后腸的吸收表面積也會改善腸道菌群[7]，表明飼料（食物）對腸道微生物類群有很大影響。

2.2 壓力對腸道微生物影響

Olsen等通過研究壓力（力竭性運動）和營養狀態（饑餓處理）對大西洋鱈魚（Gadus morhua）腸道微生物的影響，發現壓力狀態下腸粘膜在短時間通透性增加，后腸腔的微生物數量會顯著增加，一段時間后恢復到正常狀態。饑餓處理對于大西洋鱈魚腸道微生物的影響小于大馬哈魚（Salmo salar），但長時間饑餓會造成不可逆轉的影響。

Xia等學者對亞洲鱸魚進行饑餓處理，發現饑餓會造成魚腸道內菌群結構發生變化[8]。正常狀態下變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌（Bacteroidetes）是3種最為豐富的種類，然而在饑餓情況下，擬桿菌門和β-變形菌門（Betaproteobacteria）迅速增加，最為豐富以適應饑餓狀態。同時微生物的一些同源功能基因以及抗生素相關的基因在饑餓壓力下也都有顯著的不同，與抗生素相關的基因顯著富集以應對饑餓狀態，宿主與免疫相關的基因也普遍上調。Conway等發現饑餓會導致比目魚（Pseudopleuronectessp.）腸道微生物細胞體積減小以適應壓力環境，維持其生存。在對柔魚（Loligo sp.）的研究中發現類似的結果。以上結果表明內外界壓力對魚類腸道微生物菌群種類、腸道菌群生物學特征以及免疫系統都有較大影響。

2.3 不同發育階段對腸道微生物的影響

Moran等認為魚類腸道菌群結構與宿主的個體發育程度密切相關。早在2003年，Verner-jeffreys等在對大西洋比目魚（Hippoglossus hippoglossus）的研究中發現，其腸道菌群在仔魚卵黃囊階段以假單胞菌（Pseudoalteromonas）為主，而在開口仔魚階段則以弧菌（Vibrio anguillarum）為主。美國學者Bates等發現，斑馬魚胚胎和仔魚發育過程中，氣單胞菌屬（Aeromonas）和假單胞菌（Pseudomonas）在腸道微生物中占主導地位。

Yan等[9]以斑馬魚為研究對象，通過對斑馬魚從胚胎發育到性成熟發育過程中腸道微生物群落研究，發現斑馬魚腸道微生物的組成及物種豐富度的演替指數較低，而且主要隨時間發生變化，其腸道微生物群落的演替同時受生態位和隨機因素的影響。該課題組后續通過比較分析我國重要養殖魚類草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鱖魚（Siniperca chuatsi）和南方大口鯰（Silurus meridionalis）從孵化到成魚的發育過程中腸道微生物群落構建和演替，發現同種魚類在不同發育階段從環境中選擇特定微生物種類構建具有顯著差異的核心類群和群落。該研究表明魚類腸道微生物群落并非由環境微生物隨機遷入形成，而是受腸道環境及宿主發育狀態和遺傳特征等決定性因素的影響。

2.4 環境對腸道微生物的影響

魚類腸道微生物的數量和群落結構與宿主自身及其生境都密切相關。宿主對腸道微生物的影響在國內外均有報道，研究發現處于不同生長環境中的斑馬魚，腸道都存在一個核心菌群，而生活在同一水環境中的三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、銀鯽 (Carassius auratusgibelio)、青魚(Mylopharyngodon piceus)和鳊魚（Parabramis pekinensis）等水生生物腸道微生物群落都具有明顯的物種特異性和菌群結構差異[10]。

水環境和季節等變化都會引起腸道微生物菌群的改變。Romero等發現水環境對銀大馬哈魚幼魚階段腸道微生物的定植有重要影響，Leamaster等[11]研究發現紅羅非魚在水溫18℃時腸道內微生物的數量要多于26℃時腸道內微生物的數量。王瑞旋等[12]在對軍曹魚（Rachycentron canadum）腸道微生物菌群結構研究中發現，水環境的種群多樣性、群落組成及水質因子等因素和生態系統的平衡直接影響腸道微生態系統中菌群結構。Yoshimizu等研究表明，魚類腸道微生物的群落結構具有季節性差異，微生物數量在夏季最多，在冬季最少。這些研究結果表明魚類生長的水環境等對魚腸道微生物的結構有重要影響。

李存玉等[13]發現池塘和工廠化養殖牙鲆（Paralichthys olivaceus）的腸道菌群結構也有很大不同，兩種養殖條件下牙鲆腸道菌群結構與餌料、養殖水環境密切相關，表明不同養殖環境對腸道微生物也有重要的影響。

3 腸道微生物對宿主的影響

魚腸道中微生物主要是互利共生存在，腸道內的微生物同宿主的腸道環境相互作用，腸道細菌利用自身的酶系分解消化腸道內大分子物質，一部分用于自身繁殖，一部分被宿主吸收。宿主利用各種防御機制將細菌的種類和數量控制在一定的水平，以保證機體的健康生長。

先前學者對高等脊椎動物腸道微生物的研究發現，其對宿主的營養代謝和免疫調節等方面均發揮著重要作用。目前有關魚類腸道微生物的功能研究還比較少，近來隨著無菌斑馬魚培養成功，研究者可以精確定植水生動物腸道內微生物，為魚類腸道微生物功能的解析奠定了基礎。

魚類腸道微生物對宿主營養代謝的影響研究主要集中在斑馬魚，Semova等熒光標記脂肪酸類似物培養無菌斑馬魚，發現腸道微生物可以促進斑馬魚腸道上皮及肝臟對飼料脂肪酸的獲取和細胞內脂滴的形成。Rawls等[14]發現在饑餓狀態下，一些與脂代謝相關的基因在無菌斑馬魚體內表達量上調，表現出類似于正常動物處于饑餓時的生理狀態。腸道微生物同樣也會影響蛋白質代謝，無菌斑馬魚腸道末端不能吸收蛋白質大分子，表明腸道微生物在斑馬魚的脂類代謝、蛋白質代謝等過程中發揮著重要作用。

在魚類機體營養發育、消化吸收過程中，腸道微生物也發揮著重要作用。腸道菌群的分泌代謝產物中含有多種酶，能夠幫助宿主分解食物中的有機物，增強宿主對營養物質的消化吸收。黃光祥等[15]對南海底層魚突額鸚嘴魚（Scarus ovifrons）腸道的產酶微生物研究發現，其主要微生物參與產蛋白酶與淀粉酶，以促進魚體對餌料的消化吸收。Bates等發現無菌培養的斑馬魚會出現一些生理異常，如腸道上皮細胞分化出現障礙，腸道缺乏刷狀緣堿性磷酸酶活性，糖復合物表達譜尚不成熟，杯狀細胞和腸內分泌細胞數量較少等，表明腸道微生物在協助腸道食物消化、營養吸收等方面有重要作用。

腸道微生物對于機體免疫也有重要影響。腸道內有些細菌能夠分泌抗生素類物質，可阻止病原微生物侵入宿主體內。由于無菌斑馬魚存活時間不到4周，而斑馬魚獲得性免疫要4周以后才能得以體現，因此在無菌斑馬魚中研究腸道微生物對宿主免疫機制的影響主要集中在先天性免疫。一些脊椎動物常見的免疫組分如血清淀粉樣蛋白A1，細胞因子抑制因子3，補體3，C反應蛋白等同源基因在無菌斑馬魚中表達量降低，當無菌斑馬魚腸道定植適當的微生物后，這些基因的表達上調[14]，表明腸道微生物在宿主免疫系統發育和成熟過程中發揮著重要作用。腸道微生物在一定程度上也能反映機體的健康狀態。吳金鳳等[16]在研究中發現，腸道菌群對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）健康狀態有指示作用，放線菌（Actinobacteria）、黃桿菌（Flavobacterium）和芽孢桿菌（Bacillus）等有益菌的豐度在發病對蝦腸道中顯著降低，而梭狀芽孢桿菌（Clostridia）和脫硫弧菌（Desulfovibrionales）在發病對蝦腸道顯著增加，且發病對蝦腸道細菌群落多樣性顯著低于健康對蝦。

近年來，益生菌（Probiotics）和益生元（prebiotics）也逐漸應用于水產動物飼料。聶國興[17]等在羅非魚飼料中添加了木聚糖酶（xylanase），發現可以改善腸道形態結構，顯著提高尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）腸道有益菌數量，降低致病菌數量比例，并提高羅非魚抗細菌感染的能力。張梁[18]等在飼料中添加2.5%以下范圍光合細菌的飼料喂養草魚,能夠顯著提高免疫相關酶活力。Liu等[19]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）飼喂鯰魚，其生長指標、固有免疫性能和疾病防御能力與對照組相比均有明顯提高。這些結果表明益生菌/益生元作為魚類飼料添加劑，可以促進魚類生長，提高魚類免疫力。

4 腸道微生物研究方法及展望

先前學者對腸道微生物的研究，大體經歷了3個階段：培養依賴的方法、非培養依賴的傳統分子生物學方法和基于高通量測序的組學方法。培養法在處理復雜樣本時難以進行分離純培養，有一定的局限性。分子生物學的方法主要有如變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、末端片段長度多態性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，TRFLP）等指紋圖譜技術，方法操作簡單，但相對通量較低，成本較高。隨著高通量測序的發展，宏基因組（metagenomic）測序和16S r RNA測序逐漸成為腸道微生物研究的主流方法。通過高通量測序可以對腸道微生物中的所有菌種進行精確定量，研究腸道微生物菌種豐度變化。在對腸道微生物測序數據的生物信息學分析時，目前主要按照群落結構整體分析——分類單位差異檢驗——分類單位的變化與宿主其他生理指標變化的相關性分析——關鍵分類單位的功能驗證依次進行分析，不同研究者可能有所差異。

腸道微生物在魚類機體免疫和生長發育過程中都發揮著重要的作用，對于魚類腸道微生物的研究，不僅僅是研究微生物的組成，重要的是研究腸道微生物及微生態系統對宿主的影響、微生物調控宿主機體的分子機制，開發海洋微生物，產生抗腫瘤、抗菌等活性物質，以及通過對魚類腸道微生物群落結構進行研究，為開發飼料添加劑提供科學依據，指導合理使用微生物制劑等。目前關于魚類腸道微生物還有許多科學問題沒有解決，如怎樣區分魚本身的微生物和臨時性的微生物，臨時性的微生物可能在魚周圍的水膜或者混合在水或者食物存在于腸道中；在魚病治理中，改變食物可以使病魚恢復健康，因食物改變引起魚類腸道微生物菌群組成發生變化，但這些微生物變化是如何影響魚腸道而發揮作用不得而知。

隨著宏基因組學（metagenomics）概念的提出，各種宏組學技術如宏轉錄組學（metatranscriptomics）、宏蛋白質組學（metaproteomics）、宏代謝組學（metabolomics)）將會越來越多地在魚類腸道微生物研究中得以應用和發展。通過新技術方法的應用，對魚類腸道微生物群落的遺傳特性、生理生化功能基本特征進行了解，將為魚類等水生動物病害的防治以及生態健康養殖提供理論支撐，推動水產養殖業的可持續發展。

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Research progress on the fish intestinal microbiota

Zhai Wan-ying1,2，Guo An-ning1,2

(1 Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Shanghai Ocean University,Ministry of Education,Shanghai 201306, China;2 College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

The intestinal tract is inhabited by trillions of bacteria,which have an important influence on host growth and development.As an important vertebrate,fish lives in the aquatic environment,the intestinal microbiota was easily influenced by food,environment,stress and the development of host,it can also affect the nutrition, growth,reproduction and immunity of the host fish.This paper summarized the recent progress in the research of fish intestinal bacteria,including the factors influencing the fish gut microbiome,and the effect of fish intestinal microbiota.This review aimed to provide theoretic guidance for fish and aquatic animal disease control,ecological and healthy breeding to promote the sustainable development of aquaculture.

fish;intestinal microbiota;core gut microbiota;host

國家自然科學基金（31572611），上海市水產高峰學科（A12035160001B3）

翟萬營（1985-），男，漢族，河南鞏義人，助理工程師，研究方向：魚類腸道微生物

翟萬營，E-mail:wyzhai@shou.edu.cn