葡萄酒乳酸菌發酵劑研究進展

李瑩瑩，劉　葉

（甘肅紫軒酒業有限公司，甘肅嘉峪關735100）

葡萄酒乳酸菌發酵劑研究進展

李瑩瑩，劉葉

（甘肅紫軒酒業有限公司，甘肅嘉峪關735100）

蘋果酸-乳酸發酵（MLF）是葡萄酒釀造中重要的二次發酵，由乳酸菌（LAB）進行。自發進行的MLF難以控制，越來越多的葡萄酒生產商都選擇使用商業化蘋果酸-乳酸細菌（MLB）發酵劑進行MLF，因此對MLB發酵劑進行研究具有重要的現實意義。介紹了商業MLB發酵劑的發展概況、種類以及直投式MLB發酵劑。通過對目前研究重點的闡述，指出了MLB發酵劑未來研究的發展方向與創新點。

葡萄酒；MLF；MLB發酵劑

釀酒是葡萄汁到葡萄酒的生物轉化過程，釀酒酵母進行酒精發酵（AF），將葡萄汁中的糖轉化為酒精和CO2。除了進行酒精發酵，有些葡萄酒還要進行二次發酵，也就是蘋果酸-乳酸發酵（MLF）[1]。MLF是葡萄酒進行生物降酸的有效手段，可以提高葡萄酒的穩定性，改善葡萄酒的質量[2]。通常情況下，MLF是由存在于葡萄皮與酒窖中的微生物進行的，發酵時間難以預計，而且結果往往不能使人滿意[3]。接種商業蘋果酸-乳酸細菌（MLB）發酵劑逐漸成為一種趨勢，因為這不僅可以順利完成MLF，還可以減少自發發酵引起的風險[4]。對微生物來說，葡萄酒是非常惡劣的環境，因此即使使用了商業發酵劑也并不能保證順利完成發酵[5]。細菌的生長會被很多因素影響，主要是葡萄酒的理化性質和其他微生物的存在。大多數商業MLB發酵劑只含有酒酒球菌，接種這些含有單菌株的發酵劑可以促進葡萄酒快速地啟動和完成MLF，并且有助于良好風味的形成。

關于MLB發酵劑，國外研究較早，且已取得了很大的成就。很多性狀優良的MLB經過分離、篩選、冷凍干燥，已經制成商業活性MLB，在葡萄酒生產中得到廣泛應用。而我國對MLB的分離篩選工作進行的很少，還未能將國內豐富的MLB資源真正開發利用起來。目前，我國多數葡萄酒廠依靠進口活性干乳酸菌或自然發酵進行MLF，從而使生產成本極大增加。所以，充分利用國內資源，篩選適合葡萄酒生產的LAB菌種已成為我國研究人員亟須完成的課題。

1　葡萄酒MLB發酵劑概況

1.1發展歷史

1980年，冷凍干燥MLB發酵劑出現，在此之前液體MLB發酵劑使用了幾十年，冷凍干燥MLB發酵劑的使用實現了對葡萄酒MLF的控制和預測。1990年，產生了直投式MLB發酵劑。實際生產中，葡萄酒商多用直投式MLB發酵劑進行MLF[6]，因為它不僅滿足了生產者的需求，而且提高了葡萄酒的品質，使用起來也更加方便。目前，市面上有各種各樣的MLB發酵劑，大多以凍干的形式銷售，也有一些是液體形式。

1.2包含菌種

從1960年到1970年，菌株ML34是倡導“使用單一菌株誘導MLF”這一概念的標準菌株。大多數商業MLB發酵劑只含有酒酒球菌，最近的研究著重于將植物乳桿菌也應用于商業發酵劑的生產中。有研究者從巴塔哥尼亞葡萄酒中分離出植物乳桿菌進行MLF，結果表明，有2株具有作為巴塔哥尼亞葡萄酒MLB發酵劑的潛力[7]。

1.3菌株篩選標準

發酵劑中的MLB菌株篩選自自發進行MLF的葡萄酒，它們在葡萄酒中都有很好的發酵特性。商業MLB發酵劑具有非常高的活菌數（約1011cfu/g），這樣才能確保在葡萄酒中具有足夠強的生存能力。要篩選出能夠在惡劣葡萄酒環境中生長的菌株，需要制定嚴格的篩選標準。前期的研究人員已經制定了嚴格的MLB發酵劑菌株的篩選標準[8]。主要包括下面幾方面：耐低pH值、高濃度乙醇和SO2，在葡萄酒中具有良好的生長特性，與釀酒酵母有良好的兼容性，在生產過程中存活率高，不產生生物胺，不產生不良風味[9]，產生芳香成分，有利于葡萄酒風味的構成。

1.4國內MLB發酵劑發展現狀

酒酒球菌SD-2a是西北農林科技大學葡萄酒學院自行選育，并于2002年獲得國家專利的1株優良酒酒球菌。有較強的耐酒精能力，嗜酸，生長于pH 3.5～3.8的葡萄汁和果酒中，10%vol乙醇不抑制其生長。對低pH值、較高濃度SO2也有較好抗性，具有較快的MLF速率和較強的降酸能力。用SD-2a進行MLF的葡萄酒樣揮發酸升高值較低且穩定。酒酒球菌SD-2a的精氨酸代謝特性良好，不會過多降解精氨酸、產生脲、瓜氨酸等前體物質，而且不會導致致癌物質氨基甲酸乙酯的過量合成[10]。用該菌種進行MLF后的干紅葡萄酒口感柔和、潤口、協調，香氣濃郁，結構平衡，酒質明顯提高[11]。但是目前，我國MLB發酵劑的制備技術還不是很完善，細胞存活率低、保存時間短，特別是工業化生產技術還未開發出來。因此，國內還沒有廠家生產商品化的MLB發酵劑。羅華對SD-2a進行了高密度培養條件及凍干保護劑配方優化[12]。黃科建立SD-2a活性干粉生產HACCP體系，并對SD-2a干粉進行品質測定。張如金對SD-2a活性干粉的生產工藝參數及生產性能進行了進一步的研究，這些研究為酒酒球菌SD-2a活性干粉的工業化生產和推廣奠定了基礎[13]。此外，劉凱研究了昌黎產區的越千年干紅葡萄酒中分離出的60株MLB。通過酒精和酸耐性試驗表明，酒酒球菌C10和J2可以在模擬葡萄酒環境中生長（pH3.0，乙醇14%vol）。這2株菌株的蘋果酸降解率分別是每天430.625mg/L和76.994mg/L。研究表明，酒酒球菌C10和J2具有作為MLB發酵劑的潛力[14]。

2　商業MLB發酵劑種類和使用方式

商業MLB發酵劑主要有3種不同的形式：液態（liquid）、冷凍態（frozen）以及凍干粉（lyophilised）。液體懸液的保質期短，使用前需要3～7 d的準備時間。需要用不含SO2的葡萄汁活化，葡萄汁的總糖水平要調節到180g/L。如果沒有葡萄汁，也可以用已經完成MLF的葡萄酒（50%vol的總SO2小于10mg/L的葡萄酒、25%vol的水和25%vol的蘋果汁）活化，用碳酸鈣調整pH3.5～3.6，培養溫度在22～26℃。冷凍發酵劑也需要在室溫下用葡萄汁（3 L水，3 L葡萄汁和30g酵母提取物）活化。用碳酸鈣或其他緩沖液調整pH4.0，并充分混勻。加入170g已經解凍的發酵劑，密封并充分混勻，18～24℃培養48 h后接種。凍干發酵劑需要在葡萄酒與水比例為1∶1的混合溶液中活化，培養3～14 d后再添加到葡萄酒中，要求活化所用的葡萄酒pH值大于3.3，總SO2小于30mg/L。活化過程中，監控蘋果酸下降，大約2/3蘋果酸轉化為乳酸時，以體積分數5%的接種量接種到葡萄酒中。

3　直投式MLB發酵劑

直投式MLB發酵劑也是凍干發酵劑，但是使用更加方便，可以不經活化直接加入到需要進行MLF的葡萄酒中。直投式MLB發酵劑是目前葡萄酒發酵工業的一個研究熱點，其具有以下優點：活菌數高(1010～1012cfu/g)、活力高、接種量少、保質期長、產品質量穩定。直投式MLB發酵劑不需要經過活化、擴培等預處理而直接應用于生產，大大提高勞動生產率與產品質量[15]，同時減少發酵工業的生產成本與生產周期。首次用于直投的葡萄酒MLB發酵劑生產于1993年，現在已經在釀酒過程中廣泛應用。商業直投發酵劑中的細菌在培養過程中經過脅迫和馴化，在投入葡萄酒后可以更好地耐受惡劣環境。并不是所有的菌株都可以存活于馴化過程。事實上，分離到的MLB只有很少一部分可以被應用于這個生產工藝。菌株有可能因為長勢弱、ML酶活性低、或者不能幸存于這個過程而被淘汰。最后存活的菌株都是健壯的、有能力完成MLF的、可以生產出高質量葡萄酒的菌株。這些MLB發酵劑可以直接添加到葡萄酒中，某些在加入葡萄酒之前需要進行短時間的簡單活化，這樣可以使細菌均勻分布在酒中。

4　未來MLB發酵劑發展趨勢

4.1新型MLB菌株的篩選

酒酒球菌是商業MLB發酵劑包含的主要菌種，乳桿菌和片球菌也可以進行MLF，但不能發酵完全[16]。有17種不同的乳桿菌和釀酒有關，有些和葡萄有關，有些和葡萄酒AF以及MLF有關[17]。最近的實驗表明植物乳桿菌可以有效進行MLF，并可以使紅葡萄酒產生令人滿意的香氣特征[18]。有害片球菌也可以進行MLF，將商業酒酒球菌發酵劑接種到Caino白葡萄酒中進行MLF，用HPLC定量蘋果酸和乳酸，結果表明，本地有害片球菌可以優于商業酒酒球菌占主導地位，可以在Caino白葡萄酒中進行MLF，并使酒體更加成熟[19]。此外，使用從本地區葡萄酒微生物區系中篩選的菌株來進行MLF是很有利的，因為菌株對葡萄酒環境有著天然的適應能力，同時也保證了區域葡萄酒的特點[20]。

4.2MLB菌株的改良

可以通過基因重組對MLB菌株進行基因改良。一般是對目標MLB外源基因的表達或基因超表達或有害基因的去除。這通常需要導入載體質粒，但是酒酒球菌不像其他乳酸菌，質粒轉化很困難，極少成功[21-22]。另一種外源基因表達的方法是噬菌體轉導，盡管噬菌體有可能導致MLF失敗，但對酒酒球菌來說這種方法理論上也是可行的，但是目前轉導機制還不是很清楚，需要進一步的研究。還有一種基因改良的方法是轉座子，問題是當前的結合方法不能夠使酒酒球菌基因置換，因為轉移頻率遠遠低于重組頻率[23-24]。盡管基因去除或表達都是很有益的，但是把這些技術運用到酒酒球菌很困難。因此對脅迫相關單個基因的鑒定是很重要的。例如MLF中抵抗脅迫的基因涉及到多位點的多基因，并且廣泛分布在基因組，使得目標基因的操控高度復雜。影響MLF的主要脅迫因素之間不僅在物理水平相互作用，還潛在于基因水平。如果僅僅提升菌株抵抗某種脅迫的能力，有可能會使抵抗其他脅迫的能力受到不利影響。

通過非重組來改良菌株用于工業生產也是不錯的選擇，目前這種方法得到越來越多的重視。其中之一就是定向進化（DE），也叫適應進化，已經成功地運用于乳桿菌[25-28]。定向進化是對種群全基因組進行操控并使多樣化，不需要對全基因組有深入的了解。DE的前提是微生物體在連續的脅迫環境下會逐漸適應環境。有利于個體生長并繁殖的突變使菌株在脅迫環境下逐漸增長，這樣就能被篩選出來[29]。酒酒球菌是快速進化的個體，而葡萄酒又具有很強的抑制作用，這使得定向進化成為改良酒酒球菌菌株的很好的方法。但是，目前對酒酒球菌定向進化的過程還沒有完全了解，因此需要進一步的研究。

4.3不同的菌株用于生產不同的酒

根據不同的葡萄酒的類型和特點來選擇適合的菌株。多年來，MLF被認為是簡單的L-蘋果酸脫羧為L-乳酸和CO2。Henick-K ling描述了MLB的代謝活性以及對葡萄酒香氣組分的影響[30]。Richardson報道了單個MLB菌株對葡萄酒具體香氣的貢獻。某些菌株產生特征性的黃油味、酵母味以及堅果香氣，而另一些菌株可以賦予葡萄酒果香并減少生青味。MLB發酵劑將會以其對葡萄酒整體香氣輪廓的感官貢獻為特征，特定的MLB發酵劑將會有助于生產具有特定香氣的葡萄酒。

4.4誘導MLF的新技術

近年來的研究提出利用一些新技術來誘導MLF，如固定化細胞或者酶技術[31]。使用高密度的固定化細胞來進行MLF在一定程度上可以抵抗高乙醇和低pH對菌體的傷害，并且細胞可以循環利用。目前主要有2種固定化方法，細菌細胞的包裝[32-33]和附著/吸附在支撐物上[34-35]。

包埋入Lentikats?基質中的酒酒球菌細胞在14%vol乙醇以及低酸條件下蘋果酸降解率都增加。對于用此方法固定細胞進行MLF對葡萄酒組分和感官特性的整體影響，需要進一步的研究來確定。大量的研究報道了使用游離或固定化的MLB進行MLF，而使用游離或固定化M leA酶進行直接的生物轉化幾乎不曾被研究。有可能是因為這個過程需要錳（Mn+）和NAD+作為輔酶因子[36]。和游離酶相比，固定化酶在適應環境上更強和穩定[37]。但M leA酶活性最優的pH值是6.0，并且反應體系需要NAD+，這都需要進一步的研究來解決。

5　小結

為了使葡萄酒更好地進行MLF，接種商業化MLB已經成為一種趨勢。市面已經有各種類型的MLF發酵劑在售，可以滿足不同類型葡萄酒的香氣和口感需求。另外，近些年隨著分子生物學和酶技術的快速發展，MLB菌種改良和一些誘導MLF的新技術也將變成可能。與此同時，我國也要積極開展本土優良MLB菌種的篩選、凍干保護劑配方以及冷凍干燥工藝優化的相關研究，從而生產出擁有自主知識產權的MLB發酵劑，解決我國MLF發酵劑目前全部依賴進口的問題。這既有利于提高我國葡萄酒產品的質量，又有利于節約成本，提高了我國葡萄酒企業的國際競爭力。

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Research Progress in Lactic Acid Bacteria Fermenting Agent forgrapeW ine

LIYingying and LIU Ye
（ZixuanWinery Co.Ltd.,Jiayuguan,Gansu 735100,China）

Malic acid-lactic acid fermentation(MLF)is the important secondary fermentation performed by lactic acid bacteria in the production ofgrape w ine.Spontaneous MLF is hard to control.Accordingly,more and more w ineries use commercial MLB fermenting agent for MLF.The study of MLB fermenting agentwasof importantsignificance.In this paper,the developmentstatusof commercialMLB fermenting agents,their varieties,and direct-inputMLB fermenting agentswere introduced.The developmentdirections and the innovative points ofMLB fermenting agents in the futurewere discussed.

grapew ine;MLF;MLB fermenting agent

TS262.6；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0100-04

10.13746/j.njkj.2016234

2016-07-22

李瑩瑩(1990-)，女，碩士研究生。

優先數字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1021.007.htm l。