豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測方法的研究進展

文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測方法的研究進展

文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

本文綜述了豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測方法，主要包括核酸探針、普通RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環介導等溫擴增等6種方法，對豬傳染性胃腸炎病毒病的防控有一定的參考價值。

豬傳染性胃腸炎病毒；分子生物學；檢測方法

傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征的高度傳染性疾病［1］，秋始、冬春為該病高發期。該病最初發生在美國，隨后世界各地均有相關報道，我國20世紀50年代首次報道TGE，1956年臺灣省分離到TGEV。目前我國大部分地區都有該病發生流行，各種不同品種和周齡的豬都能感染TGEV并發病，2周齡受到的危害最為嚴重，一旦感染后，其死亡率可高達100%。5周齡以上的豬感染后雖然死亡率不高，但生長緩慢，飼料利用率低，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織（OIE）將其列為B類疾病中必檢的傳染病［2］。隨著分子生物學的發展，出現了許多新的檢測方法，目前已經廣泛應用于各種病毒病和細菌病的檢測，且有很好的發展前景。本文綜述了TGEV的分子生物學檢測方法，為TGE的診斷和防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針檢測方法的原理是核苷酸堿基順序互補，采用標記物標記一段可與被測定的靶序列互補單鏈核酸分子，從而檢測目的核酸序列。Kim等［3］用地高辛標記TGEV核衣殼蛋白cDNA基因序列，制備探針，建立了檢測TGEV的核酸探針方法，對25份臨床樣品進行檢測，陽性率為81%，該法與病毒分離、熒光抗體試驗、掃描電鏡的方法相比，特異性較好，可實現對病毒的快速檢測。史喜菊等［4］分別設計了豬流感病毒（SIV）、偽狂犬病病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬傳染性胃腸炎（TGEV）和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）等5種病毒的MLPA探針，將這5種探針混合，建立了可以同時檢測這5種病毒的MLPA擴增方法。該方法特異性試驗表明，針對每種病毒的探針都只能擴增出其對應的病毒模板，其余病毒模板的擴增都是陰性結果，而且5種探針混合物都只能從單個目的病毒中擴增出單一的特異性條帶，而豬細小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的擴增均為陰性。敏感性試驗結果表明，五重MLPA擴增的最低檢測限可以達到單個病毒核酸3，000～6，000個拷貝。

2 普通RT-PCR方法

參照已知的病原相關目的基因的序列，用軟件設計引物，采用相關的試劑和儀器體外大量擴增目的基因，是一種快速的分子生物檢測方法。王黎等［5］成功建立了檢測TGEV的RTPCR方法。以等量同一濃度的同一TGEV陽性病毒液進行重復性試驗，其3次擴增特異性條帶大小均為590bp。以豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（RV）進行特異性試驗，其結果顯示，僅TGEV擴增得到預期特異性目的條帶。以TGEV陽性病毒液提取的cDNA用紫外分析儀確定核酸質量濃度為1g/L后，用ddH2O按10倍稀釋，稀釋度為10-1～10-5，其均能擴增出590bp特異性條帶。張作華等［6］試驗根據GenBank中已發表的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）N基因序列設計了1對特異性引物，建立一種TGEV的RTPCR檢測方法，結果表明：該方法具有高度的特異性和較好的重復性，可檢測到1×10-3μg/μL的TGEV DNA，并可用于臨床上TGEV感染引起的傳染病病原學的檢測。

3 套式RT-PCR方法

套式PCR方法是設計內、外2對引物，通過2次擴增對樣品檢測，該法能節省時間和試劑用量，且敏感性較高。沈海娥等［7］根據豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒的S基因核苷酸序列，設計合成了2對引物，以豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒細胞培養物為模板，進行PCR特異性片段擴增，豬傳染性胃腸炎病毒擴增片段大小為886bp，豬呼吸道冠狀病毒擴增片段大小為214bp。王玉潔等［8］根據GenBank中已發表的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）基因序列，利用Primer5.0程序軟件，設計并合成了M基因的2對引物，以mRNA為模板，通過RT-PCR、RT-nested PCR方法，成功擴增出長度為1，328bp和1，037bp 的TGEV目的片段，但未擴增出豬傳染性腹瀉病毒（PEDV）片段。在優化RTPCR反應條件的基礎上，建立了快速檢測TGEV的診斷方法。母文華等［9］根據GenBank中收錄的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）纖突蛋白S基因的核酸序列設計了2對引物，以mRNA為模板，通過RT-PCR、RT-nestedPCR方法，在優化RT-PCR反應條件的基礎上，建立了快速檢測TGEV的RT-nested PCR診斷方法。試驗結果成功擴增出長度為886bp和690bp的TGEV目的片段，但未擴增出豬傳染性腹瀉病毒（PEDV）片段。

4 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR檢測方法是在普通PCR檢測方法基礎上發展起來的，可以實現在一個PCR反應體系中加入多對引物，通過優化PCR反應條件，能同時檢測多種病原，可節約成本，節省時間，目前也廣泛用于臨床各種疾病的快速診斷。郭容利等［10］建立了一種同時檢測PEDV、TGEV和豬A群輪狀病毒（PARV）的三重RTPCR方法，并對其進行特異性與敏感性試驗，該法能檢測約50TCID50的混合病毒，能夠擴增出3條長度為750bp（PEDV），544bp（TGEV），275bp（PARV）特異性片段，而其他病毒無特異性條帶。吳洋等［11］建立了可同時檢測PEDV、TGEV、PRV進行多重RT-PCR擴增，結果顯示，該方法可以同時擴增PEDV（682bp）、TGEV（480bp）和PRV（297bp）的特異性DNA片段，而對豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒的PCR擴增結果均為陰性，該法對PEDV、TGEV和PRV的檢測得到最低拷貝數分別為3.3×103拷貝/μL、3.2×103拷貝/μL和2.8×103拷貝/μL。鄭世民等［12］根據GenBank中TGEV和PEDV 的S蛋白基因序列分別設計1套特異性引物，建立了TGEV和PEDV的RTPCR快速檢測方法，該法對TGEV和PEDV擴增的目的片段的大小分別為426bp和583bp，經優化確立最佳反應體系：引物、MgCl2和dNTP濃度分別為8μmol/L、9μmol/L和14μmol/ L，退火溫度為54℃。賈銳等［13］根據GenBank中已收錄的TGEV、PEDV的序列，利用Primer5.0計合成了2對特異性引物，并用這2對引物對TGEV、PEDV cDNA模板首先進行單項PCR條件優化，然后采用正交試驗設計優化多重RT-PCR反應條件，結果同時擴增到2條與試驗設計相符的492bp（PEDV）和211bp（TGEV）特異性條帶，建立了能夠同時檢測2種病毒混合感染的特異、靈敏的多重PCR檢測方法，可檢測出約11pg的PEDV和13pg的TGEV。徐引弟等［14］建立了可同時檢測PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法，該法能同時檢測PEDV、TGEV和RV，但對CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PPV等無擴增，檢測的抗原稀釋極限為107。

5 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量PCR檢測方法是在反應體系中加入SYBR GreenⅠ熒光染料或用熒光探針標記反應產物，然后根據反應儀器收集熒光信號的強弱來確定產物的量，從而實現對起始模板進行準確定量，與常規RT-PCR相比，不需要電泳檢測就可以檢測樣品，更方便、直觀，可減少產物對環境的污染。王慧珊等［15］建立了能鑒別檢測豬傳染性胃腸炎病毒和呼吸道冠狀病毒的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，該法能同時檢測這兩種病毒，通過與常規RT-PCR試驗比較表明，所建立的熒光RT-PCR檢測技術快速、敏感，檢測限3h以內，具有很好的特異性和重復性。董玲娟等［16］建立了TGEV熒光定量RTPCR檢測方法，該法特異性高、重復性好、敏感性比普通PCR檢測方法高2個數量級，對質粒標準品的線性檢測范圍為1.0×107～1.0×101拷貝/μL。用建立的檢測方法對從陜西楊凌周邊豬場采集的30份樣品進行檢測，檢出1份陽性，與普通PCR檢測方法符合率為100%。王建中等［17］參照GenBank發表的TGEV S基因序列設計引物，通過優化反應條件，建立了檢測TGEV的熒光定量PCR檢測方法，結果顯示，該法具有良好的特異性，對其它病原的檢測結果為陰性，其檢測敏感性可達43.07拷貝/μL，是普通RT-PCR檢測方法的100倍。張雪等［18］建立一種基于SYBR GreenⅠ來進行檢測TGEV的實時熒光定量PCR方法，結果顯示，擴增效率為103%，相鄰擴增曲線之間間距均勻，所有產物的熔解曲線都具有單一整齊的峰，標準曲線具有優良的線性關系，最低可準確檢測63拷貝/μL的核酸模板，重復性試驗的變異系數小于3%，然后用建立的PCR對3種常見豬源RNA病毒的檢測結果均為陰性，對65份臨床樣品的檢出率高于常規PCR。

6 環介導等溫擴增技術

環介導恒溫擴增檢測方法（LAMP）是一種新興的分子生物學檢測方法，已廣泛應用于多種細菌病和病毒病的檢測，該法具有檢測速度快、敏感性好、特異性高且操作比較簡單等特點，適合基層獸醫部門的應用。高睿澤等［19］建立針對TGEV N基因的RT-LAMP快速檢測方法，并對該檢測方法的特異性與靈敏性進行了評價。該方法在63℃恒溫下作用50min，使TGEV N基因獲得了高效率特異性擴增，與豬流行性腹瀉病毒等其它豬易感病毒無交叉反應，具有很好的特異性，同時該方法具有極高的靈敏性，可檢測到131.4fg/μL的目標病毒DNA，比普通PCR的靈敏度高3個數量級。反應結束后加入SYBR GreenⅠ在紫外燈下觀察顏色變化，結果顯示陽性擴增產物呈現綠色熒光。

7 小結與展望

隨著分子生物學的發展，各國專家、學者先后建立了多種TGEV分子生物學檢測方法，但這些方法各有利弊，普通RT-PCR、套式RT-PCR和多重RT-PCR等方法雖然檢測簡單、快速、方便但不能精確定量，且敏感性有限，容易漏檢。熒光定量RTPCR檢測方法彌補了普通PCR方法的缺點，但所用器材和試劑成本高，且對操作人員有更高的要求，不利于其在基層獸醫部門大規模推廣應用。LAMP方法是一種新興的方法，操作簡便，不需要特殊儀器和設備，更適合基層應用。單獨使用任何一種方法都很難正確診斷豬傳染性胃腸炎病，將各種方法結合起來，綜合判斷，不同部門應該根據自己的試劑情況選擇相應的方法，相信隨著分子生物學技術的不斷發展，在不久的將來會有更多新型分子生物學診斷方法建立，從而為豬傳染性胃腸炎病毒病的診斷、分子流行病學調查和防控提供保障。

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山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學基金項目（ZR2013CQ006）；山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2014CQ010）。