不同復合因素誘導對氣虛血瘀模型建立的影響*

孫曉萍，周 軍，常秀娟，王振中，蕭 偉△

(1.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001;2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001;3.江蘇省企業院士工作站，江蘇 連云港 222001)

【實驗研究】

不同復合因素誘導對氣虛血瘀模型建立的影響*

孫曉萍1，2，3，周 軍1，2，3，常秀娟1，2，3，王振中1，2，3，蕭 偉1，2，3△

(1.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001;2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001;3.江蘇省企業院士工作站，江蘇 連云港 222001)

目的:對不同復合因素誘導的氣虛血瘀模型進行研究，探討模型建立的要點。方法:采用復合因素誘導方法造模，其中限食加強迫游泳為第1種復合因素造模方法，限食、強迫游泳加皮下注射腎上腺素為第2種復合因素造模方法，考察2種造模方法對不同性別大鼠體征及微觀指標影響的差別。結果:與正常組比較，2種造模方法均使大鼠體質量減輕，耐疲勞時間減少，免疫功能降低，全血黏度增加，內皮功能紊亂。與第1種方法比較，第2種方法造模后大鼠耐疲勞時間、體質量及胸腺指數下降更為明顯。與雌性大鼠比較，雄性大鼠耐疲勞時間長，胸腺及脾臟指數偏小，IL-4、IFN及VEGF水平偏低。結論:2種造模方法都可成功形成氣虛血瘀證，皮下注射腎上腺素后雄性大鼠對其反應更為敏感。建議在采用該方法造模時雌雄分開，或使用單一性別，此外在本實驗中發現不同性別SD大鼠具有免疫差異，且血清VEGF水平也有顯著差異。

氣虛血瘀模型;限食;強迫游泳;鹽酸腎上腺素;性別;

氣虛血瘀模型作為證候動物模型，已運用到腦血管病、腎病、心臟病、肺病、胃病的氣虛血瘀證模型中［1-2］，用于從中醫病因病機角度闡釋中藥對機體的作用機理，同時常采用微觀和宏觀指標闡明疾病過程及用藥過程中癥狀或生物標記物質的改變。根據現有文獻［3］，以單一因素或復合因素進行氣虛血瘀模型建立的方法不下7種，其中饑餓、疲勞和游泳因素為氣虛血瘀模型中常見的誘導因素，而高脂飲食、寒濕、外傷、腎上腺素、高分子右旋糖酐等因素可使機體血液呈黏滯狀態用于輔助建立血瘀證候，腎上腺素則因價格低廉、劑量及給藥方法容易掌握，建模時多采用該法。對于受試動物的選擇，各報道也未達成一致，造模過程中更多采用雌雄兼用，但也有認為不同性別大鼠血液流變學差異較大而使用單一性別的［4-6］。筆者在實驗過程中發現，動物性別及腎上腺素的使用對實驗不同指標具有較大影響，致使藥效結果的評價容易出現較大分歧，因此將以上2種因素納入考察范圍，為模型完善提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級SD大鼠雌雄兼用62只，體質量200～220 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供(合格證號SCXK(蘇)2013-0016)，按隨機數字表法分為雌性正常組、模型Ⅰ組(雌性，只執行強迫游泳)、模型Ⅱ組(雌性，執行強迫游泳及腎上腺素皮下注射)、雄性正常組、模型Ⅲ組(雄性，只執行強迫游泳)、模型Ⅳ組(雄性，執行強迫游泳及腎上腺素皮下注射)6組，每組 9～12只，大鼠分籠飼養，每籠5～6只。

1.2 試劑與儀器

鹽酸腎上腺素注射液1 mL，北京市永康藥業有限公司(批號12100241);血栓素B2(TXB2)、前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、內皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、VEGF(血管內皮生長因子)、TGF-β(轉化生長因子)、IL-4(白介素)、IFN(干擾素)放免疫試劑盒，北京華英生物有限公司(批號20150120);水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司。

賽科希德 SA-9000全自動血流變檢測儀;r—911全自動放免計數儀(中國科技大學實業總公司生產);5804R Eppendorf冷凍離心機。

1.3 實驗方法

正常組大鼠常規飼養，給予充足食水，其他組大鼠限食不限水，每日攝取正常食量的1/3(每籠大鼠每日添加飼料60～70 g)［7］，第7天將所有模型組大鼠放入水深35 cm的恒溫水槽(溫度14℃ ～16℃)中游泳，當全組 50% 的大鼠出現自然沉降時，全部停止游泳，如此連續游泳20 d，第26天記錄耐疲勞時間。模型Ⅱ組和模型Ⅳ組則在實驗第16天皮下注射0.1%腎上腺素0.4 mL·kg－1，每天1次，連續10 d。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 疲勞時間測定 從大鼠入水至其自然沉降3次所需時間。

1.4.2 血液流變學檢測 第27天大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血4 ml，肝素抗凝，測定在不同切變率下的全血黏度。

1.4.3 生物標記物及臟器指數 腹主動脈取血4 mL，3000 r/min 4℃離心10 min，取上層血清－80℃保存，放免法檢測血栓素B2(TXB2)、前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)［8，11］、內皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、血管內皮生長因子(VEGF)［9，11］、白介素4 (IL-4)、(干擾素)IFN-γ等指標;大鼠放血處理后取胸腺及脾臟稱重并計算臟器指數。胸腺指數=胸腺質量(mg)×10/體質量(g)，脾指數=脾質量(mg) ×10/體質量(g)。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，統計數據以均數 ±標準差(±s)表示，定量資料采用Kolmogorov-Smirnova進行正態性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、耐疲勞時間、胸腺和脾臟指數及免疫因子

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠耐疲勞時間顯著縮短，體質量顯著減輕，胸腺及脾臟指數均顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示2種復合因素誘導下的模型大鼠均出現氣虛乏力體征，免疫功能也出現缺陷。增加皮下注射腎上腺素這一誘導因素后，雄性動物中，模型Ⅳ組耐疲勞時間和體質量顯著降低，胸腺指數明顯減少，與模型Ⅲ組比較差異有統計學意義(P＜0.01);雌性大鼠中，模型Ⅱ組IL-4產生顯著增多(P＜0.01)，提示 Th1/Th2細胞失衡，免疫功能破壞。正常大鼠中，與雌性正常大鼠比較，雄性正常組胸腺及脾臟指數明顯偏小(P＜0.01，P＜0.05)，IL-4及IFN-γ水平明顯偏低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠體質量、耐疲勞時間、胸腺和脾臟指數及免疫因子比較(±s)

表1 各組大鼠體質量、耐疲勞時間、胸腺和脾臟指數及免疫因子比較(±s)

注:與雌性正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與雄性正常組比較:++P＜0.01;與模型Ⅲ組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

性別 組 別 例數 游泳時間 體質量 胸腺指數 脾臟指數 IL4 IFN-γ正 常 組 11 128.18± 9.18 232.36±13.63 22.00±3.11 21. 7.77±0.58 40.45±12.31 62±3.07 8.23±0.57 58.46±10.39雌性 模型Ⅰ組 12 39.92±19.53＊＊ 155.75±12.23＊＊ 6.09±3.01＊＊ 13.31±2.91＊＊ 8.53±0.54 48.49±12.27模型Ⅱ組 10 36.00±20.07＊＊ 158.40±15.30＊＊ 6.56±2.74＊＊ 13.80±3.52＊＊ 8.84±0.54＊＊48.44±17.34正 常 組 10 175.20±14.79* 294.30± 8.56＊＊ 14.08±1.82＊＊ 18.52±1.53* 7.70±0.55* 45.42± 7.82*雄性 模型Ⅲ組 9 83.44±32.88++ 222.22±23.00++ 4.82±2.15++ 12.96±2.99++8.20±0.50 37.65± 7.56模型Ⅳ組 9 49.78±14.18++△△ 204.78±16.84++△△ 2.05±1.34++△ 10.59±2.18++

2.2 各組大鼠血液流變學指標

表2顯示，與正常組比較，模型組不同切變率下的全血黏度均比空白對照組升高(P＜0.01)，紅細胞聚集指數與卡松黏度與正常組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 血管及內皮功能調控因子

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠TXB2/6-Keto-PGF1α比值均升高(P＜0.01)，提示2種復合因素誘導下的模型方法均能引起 TXB2、6-Keto-PGF1α含量的明顯變化，TXB2/6-Keto-PGF1α平衡失調，內皮功能障礙，其中模型Ⅲ組和模型Ⅳ組6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P＜0.05)，模型Ⅰ組及模型Ⅱ組一氧化氮含量明顯下降，模型Ⅲ組一氧化氮含量明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示大鼠內皮舒張功能異常［8］。與雌性正常大鼠比較，雄性大鼠VEGF含量明顯偏低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血流變比較(±s)

表2 各組大鼠血流變比較(±s)

注:與雌性正常組比較:＊＊P＜0.01;與雄性正常組比較:++P＜0.01

性別 組 別 例數 1s－1 30 s－1 50 s－1 200 s－1紅細胞聚集指數 卡松黏度雌性 正 常 組 11 25.55± 2.33 5.72±0.33 5.09±0.28 4.11±0.206.21±0.33 3.22±0.13模型Ⅰ組 12 69.93±33.88＊＊ 9.46±2.91＊＊ 7.94±2.29＊＊ 5.57±1.33＊＊ 11.31±3.32＊＊ 3.60±0.89模型Ⅱ組 10 85.20±43.62＊＊ 10.50±3.22＊＊ 8.65±2.40＊＊ 5.90±1.26＊＊ 13.54±4.26＊＊ 3.60±0.50雄性 正 常 組 10 34.14± 4.82 6.39±0.45 5.58±0.36 4.31±0.26 7.92±0.98 3.21±0.21模型Ⅲ組 9 125.70±31.54++ 14.14±0.96++ 11.49±0.74++ 7.58±0.84++ 16.10±3.38++ 4.41±0.81++模型Ⅳ組 9 115.79±14.55++ 13.36±1.14++ 10.88±0.91++ 7.21±0.62++ 15.71±1.84++ 4.41±0.47++

表3 各組大鼠血管及內皮功能調控因子比較(±s)

表3 各組大鼠血管及內皮功能調控因子比較(±s)

注:與雌性正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與雄性正常組比較:+P＜0.01，++P＜0.01

性別 組 別 例數PGF TXB TXB/6K NO ET VEGF雌性 正 常 組 11 111.51±11.81 112.77±23.07 1.02±0.22 44.7 64.07±11.46 0.60±0.18 8±7.56 73.16±14.48 0.68±0.17模型Ⅰ組 12 105.22±13.05 131.60±33.24 1.26±0.31* 36.56±7.75＊＊ 75.25±16.32 0.66±0.17模型Ⅱ組 10 106.95±13.63 135.02±22.89 1.26±0.17* 35.38±1.60＊＊ 74.95±12.73 0.64±0.19雄性 正 常 組 10 117.32±16.30 107.83±26.18 0.93±0.23 41.82±7.08 63.16±10.41 0.49±0.12*模型Ⅲ組 9 102.29±11.18+ 129.71±31.41 1.26±0.24++ 39.27±7.92 74.61±17.94 0.51±0.15模型Ⅳ組 9 103.59±11.03+ 127.84±27.79 1.22±0.18++ 35.65±2.07+

3 討論

以上2種復合因素造模方法都可成功地形成氣虛血瘀證，大鼠表現為體質量減輕，耐疲勞時間縮短，細胞免疫功能顯著降低，血藥流變呈低黏狀態、血管及內皮細胞功能紊亂，與文獻報道基本一致［12］。腎上腺素作為血小板聚集的強誘導劑［13］，可造成血小板聚集、末梢血管收縮、外周阻力增加，使得該證候成模率更高。本研究將皮下注射腎上腺素及性別作為造模影響因素分別進行評價，旨在明確這2個因素對模型微觀指標的影響。結果顯示，雄性大鼠中，皮下注射腎上腺素后大鼠的耐疲勞時間及體質量下降更為明顯，胸腺指數也明顯下降;雌性大鼠中，除血清IL-4水平有顯著差異外，2種造模方法對微觀指標的影響均無差異，提示雄性大鼠對腎上腺素更為敏感，在采用限食、強迫游泳、皮下注射腎上腺素綜合因素造模時，宜雌雄分開或使用單一性別。

已有報道發現，大鼠在免疫病變［14］或免疫指標［15］方面有性別差異。鄭國強［16］等也發現，雌性小鼠的胸腺質量和胸腺指數均大于雄性小鼠，雌性小鼠脾小體的形態結構也比雄性小鼠更完整。提示雌雄小鼠之間存著免疫差異，特別是胸腺方面。本次實驗發現，免疫差異也存在于大鼠中。實驗還發現，除免疫指標外，雌性或雄性造模大鼠的體質量、耐疲勞時間、血液流變學指標、TXB2/6-Keto-PGF1α的比值并無明顯差異，因此在不考慮免疫功能的前提下，氣虛血瘀模型建模時可以不必考慮性別因素對模型的影響，藥效學評價時也可雌雄兼用。需要考察藥物對免疫功能的影響時應考慮性別差異，避免數據上的假陽性或假陰性。

［1］王鍵，趙輝，李凈，等.多因素復合制作氣虛血瘀證腦缺血動物模型的實驗研究［J］.中國實驗動物學報，2001，4:26-30.

［2］陸為民，單兆偉，吳靜，等.大鼠慢性萎縮性胃炎癌前病變氣虛血瘀證動物模型的研制［J］.南京中醫藥大學學報:自然科學版，2000，3:156-158.

［3］樸勝華，胡因銘，郭姣.氣虛血瘀證動物模型造模方法研究評述［J］.遼寧中醫藥大學學報，2010，12(11):56-58.

［4］劉雅，張海港，張翼冠.當歸補血湯對氣虛血瘀大鼠免疫功能及相關基因的調控［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(5):10-13.

［5］李偉霞，黃美艷，唐于平.大鼠急性血瘀模型造模方法的研究與評價［J］.中國藥理學通報，2011，12:1761-1765.

［6］張宇鵬，周永生，蔣小麗.大鼠性別間中醫體質差異的初步評價［J］.上海實驗動物科學，2001，4:229-232.

［7］龐樹玲，高金亮.中年大鼠氣虛血瘀證的模擬及其機制探討［J］.天津中醫學院學報，1997，16(3):28-31.

［8］于秀華，歐喜燕.人參花提取物對氣虛血瘀模型大鼠血液流變學指標的影響［J］.遼寧中醫雜志，2012，39(10):2071-2072.

［9］扈新剛，張允嶺，柳洪勝，等.氣虛血瘀大鼠模型表征觀察及血液流變學研究［J］.天津中醫藥，2007，24(2):138-141.

［10］袁穎，郭忻，金素安.氣虛血瘀證大鼠模型血液流變學及 Th1 /Th2平衡研究［J］.遼寧中醫雜志，2013，40(6):1244-1245.

［11］榮曉鳳，李榮亨，呂霞.氣虛血瘀證大鼠 NO、ET、TXB_2、6-keto-PGF_(1α)的變化及意義［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2009，12:914-916.

［12］劉洪，李榮亨.氣虛血瘀證與血管內皮細胞相關因子的研究進展［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2005，7:553-556.

［13］紀文巖，劉英慧.腎上腺素合冷刺激致血瘀模型大鼠血栓形成標志物變化的實驗研究［J］.世界中西醫結合雜志，2010，5 (9):758-759.

［14］張巧蓮，胡巖芳，郭力.Wistar大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型性別差異研究［J］.中國免疫學雜志，2010，7:639-641.

［15］趙宏艷，王燕，肖誠.不同品系、不同性別對大鼠CIA發病情況的比較研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2010，9:761-764.

［16］鄭國強，劉安軍，滕安國.雌雄小鼠胸腺和脾臟的免疫比較［J］.安徽農業科學，2011，16:9743-9745.

Effects of Different Compound Factors on the Establishment of Qi Deficiency and Blood Stasis Model

SUN Xiao-Ping1，2，3，ZHOU Jun1，2，3，CHANG Xiu-juan1，2，3△，WANG Zhen-zhong1，2，3，XIAO Wei1，2，3
(1.Jangsu Kanion pharmaceutical Co.，Ltd，Lianyungang 222001，China; 2.State Key Laboratory of Pharmaceutical New-tech for Chinese Medicine，Lianyungang 222001，China; 3.Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province，Lianyungang 222001，China)

Objectives:To research the effect of different composite factors on Qi-deficiency and Blood-stasis model and determine the major points of model.Method:The rat models were induced by diet restriction，forced swimming or adrenalin by subcutaneous injection.One model was induced by diet restriction，forced swimming，another model was induced by diet restriction，forced swimming and adrenalin by subcutaneous injection.The signs and microcosmic index of model rats in different gender groups were observed.Results:Compared with normal group，the body weight was decreased，time of fatigue resistance was increased，immune function was decreased，and endothelial function was imbalanced in each model group.Compared with model group induced by first composite factors，model group added adrenalin by subcutaneous injection were observed less body weight，time of fatigue resistance and thymus index.The male rats were founded longer time of fatigue resistance，less of thymus and spleen index，lower level of IL-4，IFN and VEGF than female rats.Conclusion:Two modeling methods can successfully make Qi-deficiency and Blood-stasis syndrome.The male rats have more sensitive reaction after subcutaneous injecion of adrenalin，therefore we advise that rats model should be male and female apart，or using a single gender.Experiments found in SD male rats immune difference，and the serum VEGF levels have significant differences.

Qi-deficiency and Blood-stasis model;Diet restriction;Forced swimming;Adrenaline;Gender

R-33

:B

:1006-3250(2016)07-0901-03

2015-11-20

現代中藥創新集群與數字制藥技術平臺(2013ZX09402203)

孫曉萍(1981-)，女，湖北人，工程師，醫學碩士，從事藥物作用機制與藥物代謝研究。

△通訊作者:蕭 偉(1959-)，男，高級工程師，醫學博士，從事中藥新劑型的研究與開發，Tel:0518-85521956，E-mail: wzhzh-nj@tom.com。